微生物組學在葡萄枝干病害防治中的研究進展*

郭令紫，李興紅，張 瑋，彭軍波，劉 梅，周悅妍，李永華，燕繼曄

（1 北方果樹病蟲害綠色防控北京市重點實驗室，北京市農林科學院植物保護環境保護研究所， 100097）（2 中國農業大學植物保護學院）

葡萄（Vitis viniferaL.）是世界四大水果之一，具有很高的經濟價值。我國葡萄種植面積為79.79萬hm2，居世界第二，產量高達1 349 萬t，居世界首位（聯合國糧農組織2018 年數據）。在全球葡萄產業高速發展的同時，葡萄病害問題日益嚴重，其中葡萄枝干病害被認為是過去30 年來最具破壞性的葡萄病害，危害嚴重。據統計，全球葡萄種植區每年更換因枝干病害導致的壞死葡萄樹消耗超過15 億美元，美國加州葡萄年產值約為230 億美元，但因枝干病害造成的損失超過2.6 億美元[1-2]。由于目前沒有高效穩定的殺菌劑、抗病品種缺乏、農業防治成本過高，葡萄枝干病害亟需開發新的防治手段。

1 葡萄枝干病害的發生特點

葡萄枝干病害是一類真菌性病害，主要包括葡萄衰枯病（ESCA）、葡萄潰瘍病（Botryosphaeria Dieback）、葡萄頂枯病（Eutypa dieback）、葡萄蔓枯病（Diaporthe dieback）和葡萄黑根病（Black Foot Disease）等5 類，其病原十分復雜，主要包括Botryosphaeriaceae、Phaeomoniellaceae、Togniniaceae、Diaporthaceae 等9 個科中32 個屬（如Botryosphaeria、Phaeoacremonium、Eutypa、Diatrype）的真菌[3-4]，如葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）中已知引起葡萄潰瘍病的真菌包括Botryosphaeria、Diplpdia、Neofusicoccum、Lasiodiplodia等9 個屬35 個物種[5]，并且在不同的地域、氣候環境中導致同一類枝干病害發生的病原菌會有所差異[4,6]。在自然條件下，病原菌主要通過植物的氣孔、傷口等侵入葡萄[1,7]，定殖在多年生的木質化枝干中，在適合條件下導致維管束病變，在枝干中央部分產生褐色條紋或者由潰爛導致枝干變色、壞死，多數情況下還會引起葉片的黃化、壞死和變形等，最終導致葡萄在短期或長期內死亡。

葡萄枝干病害最重要的發生特點是機會性發病[4]，即病原菌以內生性的方式在健康樹體中長期潛伏[8-9]，當遇到極端環境或樹體健康不良的情況，其生活方式可由內生性轉變為致病性，從而導致枝干、葉部和果實發病[10-11]，并且存在第N 年發病、N+1 年不發病、N+2 年是否發病不可預測的情況，這種機會性發病特點與其所處的環境以及樹體的健康狀態息息相關。

2 單一生防菌株防治葡萄枝干病害的效果

植物的各個器官組織及其賴以生存的根系土壤中定殖著多種微生物，它們與植物之間存在多種作用方式，從共生到致病，這種相互作用對植物生產力、健康和微生態等起著關鍵的作用。其中益生菌可通過競爭生態位、抗生作用、誘導抗性等[12-13]抑制病原菌的生長繁殖或直接殺滅病原菌，也可附著在植物表面形成防御層，提高植物免疫力，從而產生防病促生作用。

由于葡萄枝干病害具有受環境及自身免疫力影響較大的機會性發病的“慢性病”特征，因此科研人員通過篩選并外源添加益生菌，調節植物微生態，以提高植物自身免疫力或直接抑制病原菌，以期實現對葡萄枝干病害的防治。截至目前，已有50余種不同來源的微生物菌株對葡萄枝干病害的生物防治效果被研究，如木霉菌（Trichoderma）[14]、粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea）[15]、假單胞菌MP12（Pseudomonassp.MP12）[16]、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）[17]，其中木霉菌（Trichoderma）的使用頻率最高，也只有木霉屬(Trichodermaspp.)的菌株被開發成產品，如哈茨木霉（T.harzianum）T39、AG1[14]，但其發揮功能的前提是成功并長期定殖在葡萄枝干內，具體防效受到施用方法、葡萄品種、氣候條件以及枝干病害的種類等因素的限制[4,14,18]。Patricia 等[19]發現枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）PTA-271 可增強葡萄的免疫反應，并使參與植物解毒過程的酶PAL（苯丙氨酸解氨酶）、STS（芪合酶）及GST1（編碼谷胱甘肽S-轉移酶）顯著表達，增強解毒作用，有效防治潰瘍病，但其防效具有溫度依賴性，僅在28 ℃左右有效，在實際生產中很難控制；Yacoub 等[20]發現生防菌寡雄腐霉（Pythium oligandrum）的接種能使多個涉及葡萄防御的基因[21]的表達水平顯著增加或降低，強烈地刺激葡萄的防御反應，加強對衰枯病病原菌Phaeomoniella chlamydospora的攻擊，當接種在扦插苗根部時可減少壞死40%～50%，但必須保證生防菌能成功接種并定殖在扦插苗上，其防效受其定殖情況的影響。

由此可見，使用單一生防菌株來防治葡萄枝干病害的防效不穩定，且進行菌株的純培養、篩選和制劑等過程所消耗的成本較高，不是最高效的防控手段。

3 微生物組與葡萄枝干病害發生的相關性

微生物組是指包括微生物和其基因組以及其周圍環境在內的全部[22]。近年來，微生物組研究已經取得巨大進展，并在一些領域取得了顯著的效益，特別是在作物微生物組[23]領域，科研人員利用微生物組-植物-植物病害的相互作用關系，在了解微生物組的結構與功能的基礎上，挖掘和建立核心益生微生物組或功能菌群，從微生態角度來防治植物病害，提高作物產量。

在自然條件下，植物的抗病能力與植物微生物組的組成和功能息息相關。研究表明，有益微生物組有多種抗菌防病的作用機制：產生抗菌物質或通過重寄生、生態位競爭，尤其是通過調整真菌-細菌間的平衡等作用直接抑制病原菌的增殖[19,24]；通過誘導寄主抗性或微生物生防菌活性間接抑制病原菌的致病性[25-27]；改變植物的生理狀態等以刺激植物的免疫系統，間接提高其對病原體的抵抗力，使免疫系統更有效地對抗致病菌[28]；轉化環境中所存在的營養物質，提高植物生長所需要的營養水平，并促進其對營養物質的吸收，產生直接促生作用。核心微生物組是指在自然條件下對植物發揮特異性抗逆作用的微生物集合，即可穩定、高效遺傳且維持自然微生物群體功能的最小子集[29]。因此，相較于單純依賴培養和篩選生防菌，基于微生物群落結構分析及微生物培養構建核心微生物組則可以獲得更多的益生菌資源。前者由于生防菌株單一而導致防控效果不穩定；后者所構建的核心微生物組則能夠在促進植物生長、增產和抗病等方面發揮更加持久高效的作用[18]，并已在多種植物中得以應用。冀宇等[30]利用 3 種功能菌株淡紫擬青霉（Purpureocillium lilacinum）YES-2、紅灰鏈霉菌（Streptomyces rubrogriseus）HDZ-9-47 和植物根際促生菌蒼白桿菌（Ochrobactrumspp.）NC1 人工構建并研制出一種防控黃瓜根結線蟲的功能型復合微生物菌劑，該菌劑高效、增產且環境適應性強，在田間對移栽后38 d 和105 d 病株防效達56.5%和42.5%，并使黃瓜增產10.7%，株產量達2.375 kg；諾維信旗下公司通過對植物根系微生物組的規模化分析將成功分離、培養出的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和綠木霉菌（T.virens）進行配比和成分優化，研制出田間增產效果優良且穩定的種子包衣劑，可使小麥每公頃增產220～250 kg[23]。

目前，葡萄微生物組的研究已經取得了一些進展。植物和微生物可相互影響，研究表明，多種因素可以影響葡萄微生物組，包括砧木基因型[31]、大氣[32]等，而葡萄微生物組可能與其病害的發生息息相關。

Deyett 等[33]利用微生物組分析挖掘出患皮爾斯病（Pierce’s disease）的葡萄藤汁液的核心微生物群，包括鏈球菌（Streptococcus）、擬桿菌（Bacteroides）等7 類細菌以及枝孢屬（Cladosporium）、球腔菌屬（Mycosphaerella）等5 類真菌，它們在整個物候期均存在，并在患中度皮爾斯病的葡萄中富集，且中度皮爾斯癥狀的葡萄比健康或嚴重癥狀的葡萄顯示出更高的微生物多樣性，這表明葡萄可以通過調動和調節微生物組來抵抗病原體的攻擊或參與某種關鍵的生理反應，以增強抗病力和適應能力，達到抗病的目的。同時研究者還從中確定了幾種與抗病、促生相關的細菌和真菌靶標，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）等。Asghari 等[34]發現與使用單一內生細菌防治葡萄冠癭病相比，同時使用假單胞桿菌（Pseudomonassp.）Sn48 和泛菌（Pantoeasp.）Sa14 可使植物抗毒素和病程相關蛋白防御基因的表達顯著增加并產生誘導抗性，大量研究也表明拮抗內生細菌群［包括枯草芽孢桿菌（B.Subtilis）EN631、芽孢桿菌（Bacillussp.）EN71-1 等[35]］對冠癭病的防控更加高效、穩定。

此外，研究表明微生物組可能與葡萄枝干病害的發生相關。Nerva 等[36]利用微生物組分析比較了有、無葡萄衰枯病（Esca）癥狀的葡萄根圍土壤微生物群落組成，發現其細菌和真菌群落相對豐度沒有顯著差異，但衰枯病病原體和其他枝干病病原體在有病害癥狀土壤中更為豐富，如Neofusicoccum和Phaeoacremonium是最豐富的真菌屬，且Phaeoacremonium和Phaeomoniella屬在有病害癥狀的土壤中富集，此外，芽孢桿菌屬（Bacillus）和鏈霉菌（Streptomyces）分別在有、無病害癥狀土壤中富集，推測它們可能是潛在的抗病菌種。Del Frari等[37]對發生衰枯病的葡萄枝干不同位置進行ITS 區域擴增測序和群落結構分析，結果顯示，在有、無“虎紋斑”葉片的枝干中真菌群落結構沒有明顯差異，前者中白腐病原菌嗜藍孢孔菌（Fomitiporiasp.）是優勢種群，而在后者中與衰枯病相關真菌P.chlamydospora是優勢種群，這些結果表明葡萄枝干真菌群落不受其葉片“虎紋斑”癥狀影響，反之亦然，由枝干病害病原菌引起的維管束病變可能是導致其“虎紋斑”葉片的原因。Niem 等[38]基于同一葡萄園中有、無枝干病害癥狀（潰瘍）樹體枝干內生真菌、細菌群落結構分析，發現相較于有癥狀樹體，Pseudomonasspp.在無癥狀樹體中的相對含量為56%～74%，顯著高于有癥狀樹體（2%～29%）。對分離培養所得到的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）與已知GTDs 病原菌（葡萄潰瘍病菌、葡萄頂枯病菌和葡萄衰枯病菌）進行對峙培養試驗，獲得了10 株具有拮抗活性的菌株，說明這些菌株具有作為生防菌用于防治GTDs 的潛力。

此外，對葡萄整個樹體的微生物組研究表明，葡萄地下部分的微生物群落多樣性比地上部分更加豐富，它們可通過根組織向地上部分運輸[39]，其中土壤是主要源庫[32]，同時，葡萄根際富集的鏈霉菌（Streptomycesspp.）、假單胞菌（Pseudomonasspp.）和根瘤菌（Rhizobia）是參與其磷和氮代謝最活躍的細菌[40]。這表明地下部分的益生菌群具有達到地上部分發揮抗病功效的潛力，葡萄地下部分微生物組對葡萄的生長與健康至關重要[41]。這些結果表明土壤可作為生防菌的“儲存庫”，建立抑菌菌群，這有可能成為一種潛在的有效抑制枝干病害替代方案。

因此，通過微生物組學分析界定、分離葡萄的核心益生微生物組可為防治葡萄病害提供新的理論基礎和菌種資源。雖然目前通過微生物組學來獲得核心益生微生物組，以成功防治葡萄枝干病害的研究還未見報道，但利用微生物組學來防治枝干病害是非常有希望的途徑。

4 葡萄枝干病害相關微生物組學研究方法局限及改進

通過微生物組學研究方法明確與葡萄枝干病害發生相關的微生物群落結構和功能特征是實現其應用的前提。微生物群落的基本結構和特征是該群落中微生物的物種分類與豐度、基因功能特征及不同微生物間的相互作用。目前描述微生物群落的物種豐度主要有2 類方法，即相對定量和絕對定量，毫無疑問，絕對定量對微生物群落的描述更加準確，但因其操作繁瑣，對植物內生菌的引物特異性差，目前對微生物群落研究主要使用相對定量法。

相對定量法是指提取樣品總DNA 后，利用二代或者三代測序技術對基因擴增子、宏基因組或宏轉錄組樣本進行測序，序列經過物種注釋后，依據每個物種的序列多少來進行物種豐度的描述，單個樣本中物種豐度是指不同物種OTU 序列占全部序列的比例，但當比較2 個及以上樣本的物種結構差異時，由于不同樣本的微生物總量是不同的，這種相對豐度比較可能造成失真的現象，掩蓋了樣本的真實群落結構。

目前微生物組的絕對定量方法主要有2 種。一種是向樣本中添加內參以確定樣本微生物總量。首先選擇合適的DNA 片段作為內參基因的主要序列，選擇的原則是內參序列與擴增目標序列的長度及GC 含量相似，該序列可以由隨機DNA 片段生成器生成（https://www.faculty.ucr.edu），并于其序列兩端連接測序所用引物，如16S rRNA、18S rRNA 及ITS等基因序列片段擴增所用的引物。由于土壤對裸露DNA 片段以及細菌本身的吸附性不一致，所以一般將該片段連接在載體并克隆到大腸桿菌的感受態細胞中后，再添加到樣品中，而不是直接將裸露的DNA 片段添加到樣品中。最后按照比例定量添加到土壤樣品中，混合樣本按照常規樣品進行DNA 提取、片段擴增及測序，根據測序結果中內參的序列相對豐度及實際添加量來對其他物種進行定量[42]。第2 種方法：利用qPCR 技術通過高通量測序的引物對樣本中的微生物（細菌或真菌）絕對總量進行定量，然后再根據測序數據得到的相對含量確定不同分類水平物種的絕對含量[43]。以上2 種方法僅適用于土壤等環境樣本，當檢測植物內生樣本時，由于植物中質體的DNA 中具有保守的16S rDNA 及ITS 序列，測序結果中難以區分數據來源于微生物或植物本身。針對這一問題，Guo 等[44]開發了宿主相關絕對定量分析方法（Host-associated quantitative abundance profiling,HA-QAP），該方法將植物特異基因（如水稻開花調節基因RID1）作為內參的主要序列，在兩端連接16S rRNA 及ITS 通用引物，形成內參DNA 片段，并將之按比例添加到植物和環境混合樣本DNA 中，在擴增PCR 片段前，利用qPCR對內參及樣本中的RID1基因拷貝數進行定量，之后利用高通量測序確定內參及整個樣本的reads 數，最終確定定量豐度（quantitative abundance,QA），即微生物標記基因（如16S rRNA、18S rRNA 基因及ITS）相對于植物基因組的比值。此外，由于人們常用16S rRNA 基因來對細菌進行定量，但是細菌中16S rRNA 基因存在一到多個拷貝現象，因此其結果也會造成偏差，因此，Wang 等[45]利用單細菌單拷貝持家基因rpoB來校準16S rRNA 基因，對樣本微生物群進行絕對定量，其結果更加準確。

由此可見，絕對定量法通過比較2 個樣本中的含量來確定優勢物種要比相對定量法比較相對豐度更加準確，尤其是葡萄枝干病害機會性發病，長期潛伏會造成病原菌量的變化和積累，病原菌可能因突破一定的量才開始顯癥，所以絕對定量對解釋枝干病害的發生機理以及確定核心微生物種至關重要。

此外，測序時擴增子測序是利用特異性引物擴增16S rRNA、18S rRNA 及ITS 的特定區域，也可根據研究目的不同，擴增特定的功能基因來研究某一類微生物群體，例如擴增nifH基因來研究可以進行固氮作用的微生物群體。宏基因組及宏轉錄組則是對整個樣本所有物種的基因組及轉錄組進行測序，其關注的不單是某一個基因，能夠解釋葡萄枝干病害中發揮致病或抗病功能的主要物種以及相關的基因和作用通路等功能信息，但僅是理論上的預測結果，必須要與培養組學相結合，通過分離、培養鑒定出菌株并接種，才能進一步驗證所得信息結果，并將其用于后續研究。

5 小結與展望

葡萄枝干病害機會性發病的特點致使其發病時間難以確定，防治困難，相較于單一的生防菌的篩選與應用，利用微生物組來防治是很有潛力的方法。葡萄與枝干病害的微生物組研究受到國內外越來越多的關注，但目前研究較少，雖已有報道說明葡萄微生物組與其枝干病害發生有關，但仍需對葡萄枝干病害相關的微生物組進行大量研究，特別是絕對定量微生物組法等方法的引入，可以更準確真實地闡明與葡萄枝干病害相關的微生物群落結構，為將來的核心微生物組構建及其精準移植奠定基礎。