HSV-TK/GCV系統在體外對胃癌MNK-45細胞株的增殖抑制作用研究

李 婭，張 赟，劉紅莉，皇 海，蘇明權，屈 慧（.西安市人民醫院（西安市第四醫院）檢驗科，西安 70004;.空軍軍醫大學第一附屬醫院全軍臨床檢驗醫學研究所，西安7003）

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一。尤其在我國和東南亞地區，其發病率與死亡率居于世界癌癥前列。胃癌較其它癌癥相比起病較為隱匿，發現時一般都錯過了最佳治療時機。研究發現，70%的胃癌患者發現時已經處于進展期或者晚期，失去了手術治療的機會，導致胃癌的一年生存率都很低。目前胃癌的治療方法有多種，手術治療、中醫中藥治療以及胃癌的基因治療等，但效果仍然不佳。

單純皰疹病毒胸苷激酶基因（HSV-TK）/丙氧鳥苷（GCV）系統被稱為前體藥物激活酶，能磷酸化與核苷酸結構相似的GCV，最后形成有很強毒力的代謝產物三磷酸GCV[1]。三磷酸GCV 能夠抑制細胞在分裂期基因的合成，還能夠使DNA 聚合酶表達降低，對細胞產生殺傷作用[2]。

雙歧桿菌屬于食品安全級細菌的一種，多用于生物技術的很多方面。雙歧桿菌在體內嬰兒時期含量最多，隨著年齡的增長而丟失。雙歧桿菌具有抗衰老、抑制腫瘤、降低血糖血脂、調節免疫等功能。由于雙歧桿菌具有較好的安全性，并對腫瘤組織具有靶向性，因此被廣泛地應用于腫瘤臨床靶向治療的載體。

1 材料與方法

1.1 材料 pGEX-TK 和pGEX-5X-1 由本課題組前期研究所構建，胃癌MNK-45細胞株RPMI1640培養液、胎牛血清、Transwell 小室、Matrigel 膠、0.25g/dl 胰酶-EDTA 購買于Gibco 公司；Caspaase 3，Bax，Bcl-2，Actin 等購買于Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 MTS 實驗：①將MNK-45細胞種以5×103個細胞/孔的密度種植于96 孔板。以上細胞種植在4個96 孔板上，24，48，72 以及96h 分別觀察細胞增殖情況；②在每個時間（24，48，72 以及96h）段加入MTS 試劑20μl/孔；③放入培養箱中繼續孵育4h。通過酶標儀檢測細胞的吸光度值（A）。計算方式依據以下公式：A實驗組-A空白對照組=A相對目的。

1.2.2 CCK8 實驗：運用Cell Couting Kit（CCK）試劑盒進行檢測。主要方法依據說明書進行：①細胞準備：胃癌MNK-45細胞離心后細胞計數，準備鋪板；②CCK 鋪板：密度為5×103個細胞/孔，每組設置4個副孔，分別設置4個時間點即：CCK-24h，CCK-48h，CCK-72h 以及CCK-96h；③吸光度檢測：細胞貼壁后換液，加入100μl 含有10% （v/v）CCK-8 試劑的完全培養液，孵育2 h 后，用酶標儀450nm 測定吸光度值。

1.2.3 Transwell 遷移侵襲/遷移實驗：MNK-45細胞消化后收集細胞沉淀；以1×105個細胞的密度用無血清培養液懸浮后接種于小室上層，下層加入完全培養液600μl的10g/dl FBS，放入孵箱中培養；侵襲實驗將稀釋過的Matrigel 膠涂抹在PET 膜上；取出小室，運用4g/dl 多聚甲醛固定，時間為15min；結晶紫染色10min，PBS 清洗后自然風干，顯微鏡拍照計數。

1.2.4 Western blot檢測：分別取各分組的胃癌細胞，棄去培養液后分別用0.01mol/L PBS 沖洗3 遍，在細胞培養皿中加入PMSF，蛋白酶抑制劑和蛋白裂解液，冰上裂解15min。轉移至EP 管中離心后取上清液，通過BCA 法測定蛋白濃度?？偟鞍字屑尤肷蠘泳彌_液，沸水中煮8 min，取50μg 蛋白上樣，10g/dl SDS-PAGE 凝膠電泳分離，濕轉電轉膜儀轉膜，5g/dl 脫脂奶粉室溫（37℃）封閉1h，加入兔抗人Caspase-3（1∶500 稀釋），Caspase-8（1∶1 000 稀釋），Fas（1 ∶500 稀釋），FAP-1（1 ∶500 稀釋）和β-actin（1∶500 稀釋）一抗體，室溫搖床孵育過夜，TBST 洗滌3次，每次10 min，加入相應的二抗，室溫搖床孵育1 h，TBST 洗膜3次，ECL增強化學發光試劑顯色，成像。

1.2.5 Real-time PCR試驗檢測：根據Genbank 中的基因序列，使用Primer 5.0 軟件設計4 對引物，由吉凱生物公司合成，引物擴增信息見表1。

表1 引物序列

運用Trizol 法提取各組細胞中的總RNA，進行逆轉錄合成cDNA；以cDNA為模板進行PCR 擴增。以pGEX-TK 質粒為模板，用上游引物TKF 與下游引物TKR 進行PCR 擴增。PCR 反應體系如下：總反應體積50μl，包括：2×Pfu PCR Master Mix 25μl，DNA 模板1μl，TKF 1μl，TKR 1μl，ddH2O 22μl。擴增片段大小：111 bp；設置PCR循環條件為：94℃預變性2min，94℃變性35s，63℃退火30s，72℃延伸1.5min，共進行34個循環，72℃再延伸10min。

1.3 統計學分析 統計分析運用SPSS 22.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組樣本數據間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 HSV-TK/GCV 對人胃癌細胞增殖活性的影響 將胃癌MNK-45細胞分為六組：空白對照組、GCV組、pGEX-5X-1組、pGEX-TK組、pGEXTK+GCV組、pGEX-5X-1+GCV組。通過CCK8（表2）以及MTS試驗（表3）進行各組細胞增殖活力的檢測，分別在24，48，72 和96h 觀察各組胃癌MNK-45細胞的增殖活性的差異。結果發現，GCV組、pGEX-5X-1組、pGEX-TK組、pGEX-5X-1+GCV組與空白對照組相比胃癌MNK-45細胞的增殖活性并無變化。pGEX-TK+GCV組與空白對照組相比增殖活性顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。

表2 CCK8試驗檢測HSV-TK+GCV 對人胃癌細胞增殖活性的影響

表3 MTS試驗檢測HSV-TK+GCV 對人胃癌細胞增殖活性的影響

2.2 HSV-TK+GCV系統對胃癌MNK-45細胞侵襲/遷移能力的影響為了觀察pGEX-TK+GCV 對胃癌MNK-45細胞侵襲/遷移能力的影響，通過Transwell實驗觀察6組細胞模型（空白對照組、GCV組、pGEX-5X-1組、pGEX-TK組、pGEX-TK+GCV組和pGEX-5X-1+GCV組）在24h 培養后，各組胃癌MNK-45細胞的遷移活力的改變（見圖1）以及侵襲活力的改變（圖2）。結果發現，與空白對照組相比，GCV組，pGEX-5X-1組，pGEX-TK組，pGEX-5X-1+GCV組胃癌MNK-45細胞的遷移活力并無顯著變化。pGEX-TK+GCV組與空白對照組相比其侵襲/遷移活力顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.01）。

圖1 Transwell試驗檢測各組胃癌MNK-45細胞遷移能力的影響

圖2 Transwell試驗檢測各組胃癌MNK-45細胞侵襲能力的影響

2.3 HSV-TK+GCV系統對胃癌MNK-45細胞凋亡的影響 通過Western blot檢測了各組細胞處理48h后凋亡相關蛋白的改變，凋亡蛋白包括：Cleaved Caspase-3，Bcl-2，Bax 等蛋白，結果發現，與空白對照組相比，GCV組、pGEX-5X-1組、pGEX-TK組、pGEX-5X-1+GCV組胃癌MNK-45細胞的凋亡相關蛋白并無顯著變化。pGEX-TK+GCV組與空白對照組相比其凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3，Bax 顯著升高，Bcl-2 抗凋亡相關蛋白顯著降低（見圖3），提示該組細胞凋亡發生率顯著增加，且P<0.01，差異具有統計學意義。

圖3 Western blot試驗檢測各組胃癌MNK-45細胞凋亡相關蛋白的影響

2.4 Real-time PCR檢測HSV-TK+GCV對人胃癌細胞凋亡相關蛋白的影響 通過Real-time PCR檢測了各組細胞處理48h 后凋亡相關蛋白mRNA水平的改變（見圖4），凋亡基因包括：Caspase-3，Caspase-8，Bcl-2，Bax 等蛋白，結果發現，與空白對照組相比，GCV組、pGEX-5X-1組、pGEX-TK組、pGEX-5X-1+GCV組胃癌MNK-45細胞的凋亡相關蛋白mRNA水平并無顯著變化。pGEX-TK+GCV組與空白對照組相比其凋亡相關蛋白Caspase-3，Bax 顯著升高，Bcl-2 抗凋亡蛋白顯著降低，提示該組細胞凋亡發生率顯著增加，且P<0.01，差異具有統計學意義。

圖4 RT-PCR檢測HSV-TK+GCV 對人胃癌細胞凋亡相關蛋白基因的影響

3 討論

目前腫瘤的基因治療方法研究愈發成熟，其中自殺基因相關的研究受到了廣泛關注。自殺基因（suicide gene）是利用某些病毒或細菌基因的特性，在其導入靶細胞后，再運用其表達的酶催化無毒的藥物前體轉變為細胞毒物質的原理將靶細胞殺死，這部分基因稱為自殺基因[3]。其中，HSV-TK 就是一種自殺基因[4]。HSV-TK 感染細胞后能表達TK基因，TK 能夠催化GCV 磷酸化，進而抑制DNA聚合酶，抑制細胞蛋白質的合成，達到殺傷腫瘤細胞的目的[5-6]。

利用HSV-TK 在很多腫瘤的治療中得到了驗證。前列腺癌、成神經管細胞瘤以及人類乳腺癌細胞株MCF-7 運用自殺基因HSV-TK系統均能夠有效抑制[7-10]。然而在胃癌中卻沒有報道，以胃癌MNK-45細胞為靶細胞，觀察了HSV-TK系統對胃癌MNK-45細胞增殖、遷移和侵襲的作用。結果提示與對照組相比，HSV-TK系統能夠有效地抑制胃癌MNK-45細胞的增殖，且具有一定的時間依賴效應，隨著作用時間的延長，HSV-TK系統抑制胃癌MNK-45細胞的作用就越大。胃癌細胞在臨床治療中具有較強轉移性和侵襲性，其侵襲和轉移能力較高是引起術后復發的主要誘因。本研究中同樣觀察了HSV-TK系統對胃癌細胞侵襲和轉移能力的影響，發現與對照組相比，HSV-TK系統干預能夠有效降低胃癌細胞的侵襲和轉移能力。從細胞的增殖、遷移和轉移能力均發現HSV-TK 具有顯著的干預效果。然而，研究發現人體細胞中的TK 基因并沒有殺滅腫瘤細胞的功能。因此，要想外源性TK 基因在人體腫瘤的治療中發揮作用，需要尋求一種安全、有效的載體就顯得尤為重要。本實驗的研究結果僅僅是體外的研究，并未進行體內胃癌的治療，可能在體內的治療效果上會有一定的局限性。

另外，為了進一步證實HSV-TK系統干預腫瘤細胞生長的分子機制[11-12]，本研究還觀察了HSVTK系統作用后細胞凋亡相關蛋白的改變。結果顯示，HSV-TK系統能夠促進促凋亡蛋白caspase3的剪切以及Bax 蛋白的表達增加[13-16]，同時還能夠抑制Bcl-2 抗凋亡蛋白水平的表達。提示HSV-TK系統能夠促進胃癌細胞的凋亡發生，這可能是HSVTK系統抑制胃癌細胞增殖的主要機制。