基于GEO數據庫對類風濕性關節炎相關基因篩選及生物信息學分析

陳龍梅，楊振華（上海市寶山區中西醫結合醫院檢驗科，上海 201900）

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA）主要累及周圍關節，可導致多處周邊關節畸形[1]。因機體的免疫細胞的異常增殖以及自身凋亡動態的失衡，同時激活了異常的氧化應激，導致多種信號傳導通路失衡，從而引起了RA 疾病的發生發展[2]。隨著大數據時代的到來，迎來了基因芯片數據的大量發展[3]，各種疾病包括RA的基因表達譜也得到了學者的重視。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類非編碼但在調控蛋白合成過程中有著不可或缺功能的RNA，它主要通過特異性地結合其他基因或蛋白質從而起到重要的生物學作用[4]。夏燕等人[5]注意到有多條lncRNA 能夠影響RA患者，本研究擬通過從GEO（gene expression omnibus）數據庫下載并整理有關RA的生物信息分析的lncRNA 基因微陣列數據，通過分析差異表達的LncRNA，探討LncRNA 在RA 發生發展的作用，從而探索RA 新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 芯片數據來源 通過GEO(gene expression omnibus)數據庫，以“Rheumatoid arthritis”為關鍵詞搜索目標，經篩選后，采用由Xu D 等提交以GPL20115為平臺的基因芯片GSE94519，包含由3例RA患者(GSM2477389～GSM2477391) 和3例健康人(GSM2477392～GSM2477394)構成的6例樣本，均為LncRNA表達譜數據。

1.2 RA的差異表達基因分析 應用GEO數據庫的在線分析工具GEO2R 進行分析，GEO2R 采用了R 語言中GEOquery 以及limma 程序包，再以P<0.05，|logFC>1.5|為篩選條件，挑選RA的差異表達基因。

1.3 RA差異基因的功能分析 采用DAVID 在線分析工具（https://david.ncifcrf.gov/)對差異基因開展GO 功能注釋和KEGG 信號通路富集分析。GO 功能主要包括三個方面，分別是生物學過程（biological process,BP），細胞定位（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）。

1.4 RA的差異表達基因所調控蛋白互作網絡與關鍵基因分析 通過蛋白質相互作用數據庫STRING11.0（https://sring-db.org/)探索RA差異基因間編碼的蛋白質間的關系，并建立它們間蛋白質互作網絡（protein protein interaction network，PPI）。并將PPI結果在Cytoscape 軟件中打開編輯，以cytoHubba模塊計算PPI 網絡節點的前10 名蛋白網絡中有較高連接度的hub 基因。

2 結果

2.1 RA差異基因 根據RA差異基因的篩選條件，在GSE94519 基因芯片中共有差異表達基因278個，其中上調54個，下調224個，其火山圖見圖1。按照差異倍數logFC 大小排序，前三個上調基因為微管相互作用和運輸1（MITD1），乙酰輔酶A 羧化酶α（ACACA），損傷特異性DNA 結合蛋白1（DDB1）；前三個下調基因為神經肽原（NPTN），原肌球蛋白α（TPM1），凝血因子XIII，A1 多肽（F13A1）。

圖1 RA差異基因火山圖

2.2 RA差異表達基因的GO 功能和調控通路分析 RA差異基因在DAVID6.8 中的GO 功能和KEGG 通路分析見表1。GO 功能在BP 中主要過程為血小板脫顆粒、病毒過程、氧化還原過程、GTPase 活性正調節，在CC 主要存在于胞外小體、胞漿、薄膜及細胞質，在MF 主要發揮GTPase 活性、泛素蛋白連接酶結合、鈣黏蛋白結合參與細胞間黏附和GTP連接功能。調控的信號主要為調節氧化磷酸化以及帕金森病的信號通路。

2.3 RA差異表達基因所調控蛋白互作網絡與關鍵基因分析 除去孤立無關系的蛋白節點，以RA差異表達基因構建蛋白質相互作用網絡，互作關系的蛋白質共251個，構成495條復雜的PPI 網絡，將網絡在Cytoscape 軟件中進行可視化，見圖2。通過cytohubba 插件確認Hub 基因，結果顯示Hub基因分別為ACTB，RHOA，PPBP，B2M，MTCYB，PF4，CFL1，MT-ATP6，VCL和TPM1，數據顯示它們之間可能存在較強的相互作用關系。

3 討論

RA 由于其高致殘率而引起了社會的廣泛關注，但其致病機制尚不明確[6]。RA 嚴重影響著患者的生活質量，所以進一步尋找有助于RA 早期診斷和治療的分子靶點至關重要。在本研究中，我們使用了GEO2R 在線工具分析了GEO 中的芯片數據GSE94519 共包含了3例RA患者和3例健康人構成的6例樣本。根據篩選條件得到了278個差異表達基因，通過DAVID6.8 對差異基因進行GO 功能注釋和KEGG 信號通路分析發現差異基因主要參與了血小板脫顆粒、病毒過程、氧化還原過程、GTPase 活性正調節的轉導過程和調控氧化磷酸化和帕金森病等通路。

表1 RA差異基因的GO 功能和調控信號通路的前20個基因

運用蛋白互作數據庫STRING11.0 以及Cytoscape 軟件分析差異基因，發現Hub 基因分別為ACTB，RHOA，PPBP，B2M，MT-CYB，PF4，CFL1，MT-ATP6，VCL，TPM1。β-肌動蛋白（β-actin，ACTB）是一種細胞骨架肌動蛋白，其蛋白表達與血小板聚集、凝血、纖維蛋白凝塊形成相關[7]。RHOA 蛋白是小G 蛋白超家族的亞家族成員之一，具有GTP 酶活性，其相關的信號通路在RA患者關節成纖維樣滑膜細胞(FLS)遷移、侵襲、增殖的調控作用較多地被研究[8]。原血小板堿性蛋白（Pro-Platelet basic protein，PPBP）又名趨化因子7（C-X-C motif chemokine ligand 7,CXCL7）或中性粒細胞活化肽2（neutrophil-activating peptide-2，NAP-2），為CXC 趨化因子家族的血小板衍生生長因子，能夠促進淋巴細胞和內皮細胞激活，誘導炎癥應答，且PPBP 在RA 滑膜液中表達出現下調[9]。B2M 基因在人體中編碼β2 微球蛋白，RA患者的血β2 微球蛋白高于正常人群，這可能與RA的炎癥途徑有關[10]。血小板第4 因子（platlet factor 4，PF4）是由血小板α 顆粒合成的一種特異蛋白質，可促進滑漠細胞的增殖與局部抗體的產生等作用，參與RA的免疫應答和趨化因子信號通路[11]，通過與其它細胞因子相互作用介導RA 發生發展中骨及軟骨的破壞。MT-ATP6是線粒體ATP 合酶亞基6 基因，它是線粒體能量合成過程中的一個關鍵酶，根據功能有學者預測認為MT-ATP6 具有潛在的RA 致病性[12]，篩選出的Hub 基因中MT-CYB，CFL1，VCL和TPM1 目前尚未找到相關的研究，有可能是RA 潛在的早期診斷的基因靶點，為后續的研究打下基礎。

本研究是通過探索GEO數據庫中的芯片GSE94519 數據，從而得到RA的Hub 基因，從而進一步研究RA的發病機制、功能和通路分析為RA的發生發展尋找新的作用靶點提供了新的思路。