癲癇患者血漿Glu，Asp，Gly和GABA水平檢測與智力缺損程度的相關(guān)性研究

漆 明，王 宇，李 春，黃 翔(廣西腦科醫(yī)院.檢驗科；.神經(jīng)內(nèi)科，廣西柳州 545005）

資料顯示，我國癲癇的總患病率接近3‰，每年新發(fā)病例約50萬人，且呈逐年上升趨勢[1]。與此同時，伴有智力（認知功能）缺損的癲癇患者達30%～40%[2]。智力缺損（障礙）是癲癇患者的常見共患癥之一，伴有智力缺損的癲癇患者比例不低。智力缺損已經(jīng)成為臨床醫(yī)生診治癲癇患者必定考慮的內(nèi)容[3]。近年來，在對癲癇及其智力缺損的發(fā)病機制研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作與體內(nèi)興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸（glutamic acid,Glu），天冬氨酸（aspartic acid，Asp)含量的增高或抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），甘氨酸（glycine，Gly）含量的下降有關(guān)，但具體發(fā)病機制研究未明。目前對癲癇患者血漿Glu，Asp，Gly 及GABA水平與智力缺損程度的研究目前報道較少。本研究旨在探討癲癇患者血漿4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)：Glu，Asp，Gly 及GABA水平與智力缺損程度的關(guān)系,為研究癲癇患者智力缺損的發(fā)病機理及臨床診治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018年8月～2019年11月廣西腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診或住院病人中符合《2010年國際癲癇聯(lián)盟診斷標準及分類方案》的癲癇病患者82例為研究組，男性37例，女性45例，平均年齡36.5±11.2歲，排除嚴重心、肝、腎等器質(zhì)性疾病、腦血管疾病、急性腦外傷、失語、癱瘓等神經(jīng)系統(tǒng)嚴重器質(zhì)性病變和精神障礙患者。對照組為30例同期健康體檢人員，平均年齡37.8±12.6歲，兩組間性別構(gòu)成比及平均年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。所有研究對象及對照組均志愿加入研究并簽署知情同意書，本研究獲廣西腦科醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 儀器及試劑 氨基酸測定儀器為島津超高效液相色譜與三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)。具體配置為：輸液泵（LC-20ADXR CL×2），在線脫氣機（DGU-20A5R CL），自動進樣器（SIL-20ACXR CL），柱溫箱（CTO-20ACXR CL），系統(tǒng)控制器（CBM-20A CL），三重四極桿質(zhì)譜儀（LCMS-8040 CL），色譜工作站（LabSolutions Ver.5.91）。分析條件：①色譜條件色譜柱：氨基酸專用色譜柱；流動相 A0.1g/dl 甲酸水溶液；流動相 B 0.1g/dl 甲酸乙腈；流速：0.35ml/min；柱箱溫度：40℃；進樣體積：1μl；洗脫方式：等度洗脫；A 相濃度：98%。B 相濃度：2%。②質(zhì)譜條件：分析儀器：LCMS-8040 CL；離子源：ESI (+)；霧化氣流速：3.0L/min；干燥氣流速：15.0 L/min；DL 溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。

1.3 方法

1.3.1 血漿樣品采集、前處理及氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的測定：研究組及對照組均采集空腹靜脈血5～6ml，EDTA 抗凝，離心10min（3 000r/min），吸取血漿于2ml 凍存管中，低溫（-70℃）保存；檢測時將血漿樣品室溫解凍，離心10min（3 000r/min），吸取100μl 離心后的上清液到新的離心管中，加入300μl 甲醇乙腈去蛋白沉淀劑（乙腈:甲醇=1:1），靜置3 min，渦旋2 min 混勻，離心10分鐘（13 000r/min）,取120μl 上清液，按1.2 色譜及質(zhì)譜條件分析，進樣體積1μl。

1.3.2 標準貯備液制備：實驗所用試劑均為質(zhì)譜純。Glu，Asp，Gly和GABA 購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為德國默克(Merck)公司生產(chǎn)。準確稱取4種氨基酸標準品各20mg，分別置于50ml 容量瓶中，用0.1mol/L 乙酸定容至刻度，配制成400μg/ml的氨基酸儲備溶液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 標準曲線的建立:將前述4種氨基酸貯備液用純水稀釋成濃度為10～4 000ng/ml 若干梯度濃度的混合標準溶液，按前述1.3.1～1.3.2條件及處理方法處理后上機進樣分析。以氨基酸濃度為橫坐標，以氨基酸峰面積為縱坐標，采用外標法建立標準曲線。

1.3.4 FIQ 測定及分級：智力缺損程度以智商測量表(FIQ)值表示，由本院有經(jīng)驗的心理測試師采用韋氏成人智力測試量表(WAIS-RC)完成。測量分項目包括數(shù)字廣度、相似性、知識、圖畫填充及木塊圖案等。FIQ 測定值分組：FIQ>90分為正常，80～89分為低于正常，70～79分為臨界，50～69分為輕度缺陷，35～49分為中度缺陷，20～34分為重度缺陷，<20分為極度缺陷。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料服從正態(tài)分布以均數(shù)±標準差（x±s）表示，差異比較采用t檢驗；相關(guān)性分析采用Sperrman 秩相關(guān)法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 癲癇組及照組血漿4種氨基酸檢測結(jié)果 見表1。按1.2～1.3 分析條件及處理方法對兩組血漿樣本進行4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量測定。癲癇組血漿Glu，Asp水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；Gly，GABA水平低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。

表1 癲癇組與對照組血漿4種氨基酸檢測結(jié)果(±s，ng/ml)

表1 癲癇組與對照組血漿4種氨基酸檢測結(jié)果(±s，ng/ml)

項 目 癲癇(n=82) 對照(n=30) t P Glu 38.00±2.26 9.10±1.48 64.916 <0.001 Asp 10.01±1.76 2.53±1.17 21.502 <0.001 Gly 45±3.18 63.00±4.31 23.891 <0.001 GABA 27.00±3.49 54.00±2.72 38.206 <0.001

2.2 癲癇組及對照組智商測量表(FIQ)測定結(jié)果比較 見表2。癲癇組FIQ 平均分值（64.43±16.11）低于正常對照組（101.50±31.40），差異有統(tǒng)計學意義 (t=8.557，P<0.001)。癲癇組FIQ 異常的總構(gòu)成比為96.3%，其中智力低于平常水平者（FIQ=80～89）占10.9%，智力低于臨界水平者占19.51%，智力障礙者占63.85%；癲癇組在數(shù)字廣度、相似性、知識及圖畫填充及木塊圖案方面分值均低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(t=5.306～21.685，均P<0.001)）。見表2。

2.3 癲癇患者血漿Glu，Asp，Gly，GABA水平與智力缺損程度之間的相關(guān)性分析 見圖1～4。癲癇組FIQ分值與血漿Glu，Asp水平呈正相關(guān)（r=0.879，0.724，均P＜0.01），與Gly，GABA水平呈負相關(guān)（r=-0.775，-0.459，均P＜0.01）；正常對照組FIQ 分值與血漿Glu，Asp，Gly 及GABA濃度無相關(guān)性。

表2 癲癇組與對照組智商評分比較

圖1 Glu與FIQ評分相關(guān)性分析

圖2 Asp與FIQ評分相關(guān)性分析

圖3 Gly與FIQ評分相關(guān)性分析

圖4 GABA與FIQ評分相關(guān)性分析

3 討論

Glu，Asp，Gly和GABA是人體內(nèi)重要的氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，參與維系腦部的血液循環(huán)，對神經(jīng)系統(tǒng)的功能起著重要的介導(dǎo)作用。研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu，Asp 和抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)GABA，Gly 參與癲癇的發(fā)病過程，其平衡一旦被打破，可能導(dǎo)致癲癇發(fā)作及智力下降[4]。癲癇發(fā)作可引起細胞外Glu 升高，進而引起興奮性毒性損害，慢性癲癇發(fā)作可改變神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞上的谷氨酸受體和谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達，進一步促進癲癇發(fā)生。明確氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)在癲癇患者體內(nèi)水平的變化及其與智力缺損的相關(guān)性，對癲癇及其智力缺損的診斷、治療均有重要意義。吳浪龍等[5]研究發(fā)現(xiàn)興奮性氨基酸的毒性作用是造成癲癇患兒腦損害的主要原因。血腦屏障的存在，血腦屏障中的氨基酸轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)能將血漿氨基酸轉(zhuǎn)運至大腦，同時將腦中神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸逆濃度梯度轉(zhuǎn)運至血液[6]，靜脈血和腦脊液內(nèi)氨基酸水平存在著一定的相關(guān)性[7]。王曉梅等[8]發(fā)現(xiàn)癲癇患者腦脊液中GABA 含量低于正常對照組，Glu 高于正常對照組。王威等[9]研究發(fā)現(xiàn)：癲癇患者的基礎(chǔ)血清Glu，GABA 和谷氨酰胺水平明顯高于健康對照組；張赟等[10]研究認為：與癲癇的發(fā)作密切相關(guān)的氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu 及GABA 分別是最重要的興奮性與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。本研究癲癇組血漿興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu，Asp水平高于對照組，而抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Gly，GABA 低于對照組，與前述吳浪龍等[5]研究結(jié)論相似。證明前述4種遞質(zhì)Glu，Asp，Gly和GABA 與癲癇的發(fā)病相關(guān)。本研究癲癇組FIQ 異常的總構(gòu)成比為96.3%，癲癇組在數(shù)字廣度、相似性、知識及圖畫填充及木塊圖案等測量項目的分值均低于正常對照組，其中智力障礙患者發(fā)生率（63.85%）高于國內(nèi)宋新勤[11]等的報道。

血液學標志物應(yīng)用于癲癇患者的智力缺損程度評估目前研究較少。國內(nèi)通常采用智力量表測量法或功能神經(jīng)影像學檢查（如MRI）法單獨或聯(lián)合進行評估癲癇患者的智力缺損程度。國內(nèi)王麗麗等[12]檢測癲癇患者血清觸珠蛋白(haptoglobm，HP)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，聯(lián)合蒙特利爾認知評估量表(MoCA)對癲癇患者進行認知功能分級，發(fā)現(xiàn)老年急性腦出血并發(fā)癲癇患者血清SOD，MDA，HP的表達水平與認知功能損害的嚴重程度相關(guān)。目前國內(nèi)FIQ評估法包括龔耀先修訂的韋氏成人智力量表中國修訂版（WAIS-RC）、簡易智能精神狀態(tài)檢查量表（MMSE）、蒙特利爾認知評估量表（MoCA）[13-15]等。由于 WAIS-RC 每個測試分項的分值與最終智商得分密切相關(guān)，其準確性依賴于檢測過程的連貫性，當外界干擾、患者注意力缺陷或疲勞等情況使檢測意外中斷會導(dǎo)致結(jié)果失準。張鵬[16]利用三維動脈自旋標記技術(shù)研究單獨全面性強直陣攣癲癇患者全腦血流量的變化情況，結(jié)合蒙特利爾認知評估量表(MoCA)進行認知功能評價研究發(fā)現(xiàn):單獨全面性強直陣攣癲癇患者存在認知功能下降。但功能神經(jīng)影像學檢查存在特異度不高等諸多缺點。本研究通過對82例癲癇患者及30例健康正常人血漿氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu，Asp，Gly和GABA水平及FIQ 分值測定，發(fā)現(xiàn)癲癇患者血漿Glu，Asp水平與FIQ 分值呈正相關(guān)，血漿Gly，GABA水平與FIQ 分值呈負相關(guān)，相關(guān)性優(yōu)于前述張鵬及王麗麗等[12,16]采用的方法。

綜上所述，癲癇患者血漿氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu，Asp，Gly，GABA水平可能是癲癇患者智力缺損程度的潛在標志物，對癲癇及其智力缺損程度的診斷、評估和治療有一定的臨床價值。