草香胃康膠囊中7種成分的含量測定及聚類分析

張 凱，馬靈珍

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)管理部，沈陽 110032；2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，亳州 236800)

草香胃康膠囊由木香、阿魏、決明子、雞內(nèi)金、海螵蛸和牡蠣6味中藥制成，主治胃脘疼痛、饑后尤甚、泛吐酸水、食欲不佳和心煩易怒等肝氣犯胃所致胃痛、胃及十二指腸球部潰瘍、慢性胃炎等癥[1]。草香胃康膠囊現(xiàn)收載于《中國藥典》2015年版一部，標(biāo)準(zhǔn)中僅對佐藥決明子所含大黃酚進(jìn)行了定量研究，而大黃酚來源廣泛，作為草香胃康膠囊定量測定指標(biāo)成分專屬性不強(qiáng)，同時檢索到與該制劑定量檢測相關(guān)的文獻(xiàn)也僅限單一組分檢測[2-6]。中藥及其制劑具有多靶點(diǎn)、整體協(xié)同作用等特點(diǎn)，單一組分檢測具有一定的片面性，多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式近年來已廣泛應(yīng)用于其質(zhì)量控制中。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)君臣佐使中醫(yī)組方理論，選取以下成分為檢測指標(biāo)：君藥木香所含指標(biāo)性成分木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯，臣藥阿魏所含活性成分阿魏酸，佐藥決明子所含代表性成分紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素，采用HPLC法同時測定草香胃康膠囊中7種成分的含量，并采用統(tǒng)計軟件對所測含量進(jìn)行聚類分析，為全面評價草香胃康膠囊的整體質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；ME204E型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-500E型臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 對照品：阿魏酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.4%，批號110773-201915)，木香烴內(nèi)酯(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%，批號111524-201911)，去氫木香內(nèi)酯(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%，批號111525-201912)，橙黃決明素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.3%，批號111900-201605)，均購自中國食品藥品檢定研究院；紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.5%，批號PRFM90308-04)，美決明子素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%，批號PRF8101721)，均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；決明子苷C(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%，批號CFS201901)，購自武漢天植生物技術(shù)有限公司。乙腈，色譜純，德國Merck公司；其他試劑均為分析純，均購自上海吉至生化科技有限公司。草香胃康膠囊(規(guī)格：0.5 g·粒-1，批號分別為280084、280086、280088、280094、280102、280107、280063、280075、280077、280079，編號分別為S1～S10)，均購于廣西玉林制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素對照品各適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.112、0.378、0.406、1.182、0.454、0.338、0.262 mg·mL-1的混合儲備液。精密吸取上述儲備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別用甲醇稀釋至20 mL，制成系列溶液1～6；取系列溶液3作為混合對照品溶液(7種成分質(zhì)量濃度分別為5.6、18.9、20.3、59.1、22.7、16.9、13.1 μg·mL-1)。

2.1.2供試品溶液的制備 取草香胃康膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取1.0 g，加入25 mL甲醇，稱質(zhì)量，超聲處理45 min，放冷后用甲醇補(bǔ)質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得草香胃康膠囊供試品溶液。取按草香胃康膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)處方比例及制法制備的缺木香、缺阿魏、缺決明子的陰性供試品適量，按上述方法制成陰性供試品溶液。

2.2色譜條件 以乙腈-1 mL·L-1甲酸為流動相，流速：0.8 mL·min-1。梯度洗脫，洗脫程序：0～8 min，12%乙腈；8～19 min，12%～25%乙腈；19～27 min，25%～42%乙腈；27～36 min，42%～65%乙腈；36～40 min，65%～12%乙腈。Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。檢測波長：320 nm(0～12 min檢測阿魏酸)[5-11]，225 nm(12～19 min檢測木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯)[12-15]，284 nm(19～40 min檢測紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素)[16-19]。精密吸取2.1.1項(xiàng)下混合對照品溶液及2.1.2項(xiàng)下溶液各10μL，進(jìn)樣分析檢測，記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果在供試品色譜圖中7種成分色譜峰峰形對稱，拖尾因子符合《中國藥典》規(guī)定，分離度均>1.5；理論板數(shù)按7種成分色譜峰計算均≥3 500，陰性樣品對草香胃康膠囊中7種成分的測定無干擾。

圖1 HPLC圖A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.阿魏陰性樣品；D.木香陰性樣品；E.決明子陰性樣品；1.阿魏酸；2.木香烴內(nèi)酯；3.去氫木香內(nèi)酯；4.紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷；5.決明子苷C；6.橙黃決明素；7.美決明子素。Fig.1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance solution；B.sample solution；C.negative sample without Ferulae Resina；D.negative sample without Aucklandiae Radix；E.negative sample without Cassiae Semen；1.ferulic acid；2.costunolide；3.dehydrocostuslactone；4.rubrofusarin-6-O-β-gentiobioside；5.cassiaside C；6.aurantio-obtusin；7.obtusifolin.

2.3線性關(guān)系考察 精密吸取2.1.1項(xiàng)下6個系列溶液各10 μL，進(jìn)樣分析檢測草香胃康膠囊中7種成分的峰面積，以各成分的峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸，得7種成分的回歸方程、線性范圍及r值。見表1。

表1 7種化合物的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of the 7 constituents

2.4精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.1.1項(xiàng)下混合對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣檢測6次，測得7種成分峰面積的RSD值分別為1.13%、0.99%、0.91%、0.56%、0.67%、0.83%、1.04%。

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取草香胃康膠囊6份，按2.1.2項(xiàng)下步驟配制供試品溶液，依法進(jìn)樣分析檢測，記錄所檢測成分的峰面積，計算，得7種成分含量的RSD值分別為1.87%、1.63%、1.76%、0.92%、1.35%、1.69%、1.77%。

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按2.1.2項(xiàng)下步驟臨用新配1份草香胃康膠囊供試品溶液，于0、2、4、6、12、18 h進(jìn)樣檢測7種成分的峰面積，結(jié)果供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定，7種成分峰面積的RSD值分別為1.09%、1.01%、0.88%、0.57%、0.71%、0.82%、0.98%。

2.7回收率實(shí)驗(yàn) 取7種成分含量均已知的同一批草香胃康膠囊9份，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取0.5 g，3份，分別精密加入混合對照品溶液(根據(jù)樣品中化合物含量另行配制，7種成分質(zhì)量濃度分別為0.029、0.104、0.139、0.432、0.161、0.089、0.067 mg·mL-1)1.0、2.0、3.0 mL，再按2.1.2項(xiàng)下步驟制成加樣供試品溶液，進(jìn)樣分析檢測7種成分的峰面積并計算其含量。7種成分回收率及RSD值見表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests (n=9)

2.8樣品含量測定 取10個批次的草香胃康膠囊，按照2.1.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，各批次平行制備3份，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測7種成分的峰面積和含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果Tab.3 Results of the sample content determination

2.9聚類分析 為了考察不同批次草香胃康膠囊中7種成分的含量差異，采用SPSS 26.0軟件組間聯(lián)接聚類方法，以歐氏距離為測度，對10批草香胃康膠囊進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)類間距離為10時，10批樣品聚為4類，S1、S3、S2、S4聚為第一類，S5、S6聚為第二類，S9、S10、S8聚為第三類，S7為第四類；當(dāng)類間距離為15時，10批樣品聚為2類，第一類和第二類合并為一類，第三類和第四類合并為另一類。由分類結(jié)果可知，目標(biāo)化合物含量差異與樣品相關(guān)，可能與草香胃康膠囊生產(chǎn)所用原藥材的產(chǎn)地來源、采收時節(jié)以及原藥材不同批次間的質(zhì)量差異有關(guān)。

圖2 10批草香胃康膠囊聚類分析樹狀圖Fig.2 Cluster analysis tree diagram of 10 batches of Caoxiang Weikang Capsules

3 討論

3.1目標(biāo)化合物的確定 草香胃康膠囊由阿魏、木香、決明子、雞內(nèi)金、海螵蛸和牡蠣6味中藥材配伍而成，方中木香行氣止痛、健脾消食、調(diào)暢氣機(jī)而解郁，雞內(nèi)金健胃、消積食，共為君藥；阿魏消積化瘕，可增強(qiáng)君藥雞內(nèi)金的消食化積之功，為臣藥；決明子清熱明目、潤腸通便，海螵蛸收斂止血、制酸止痛，牡蠣軟堅(jiān)散結(jié)、重鎮(zhèn)安神，共為佐使藥。諸藥合奏，以達(dá)泄肝和胃、行氣止痛的臨床功效。木香為菊科植物木香的干燥根，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯為其指標(biāo)性成分；阿魏為傘形科植物新疆阿魏或阜康阿魏的樹脂，阿魏酸為其主要活性成分；決明子為豆科植物決明或小決明的干燥成熟種子，紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素等為其代表性成分。本文參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，選取阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素為定量測定目標(biāo)成分，為全面評價草香胃康膠囊的整體質(zhì)量提供參考。

3.2流動相的選擇 在進(jìn)行梯度洗脫時，本實(shí)驗(yàn)先后考察了甲醇-水[12-13]、甲醇-3 mL·L-1冰醋酸[5-7]、乙腈-1 mL·L-1磷酸[16，18-21]和乙腈-1 mL·L-1甲酸[17]4個流動相體系。結(jié)果顯示，以乙腈-1 mL·L-1甲酸為流動相時，基線平穩(wěn)，7種成分色譜峰對稱度良好，且與相鄰色譜峰分離效果較好。故采用乙腈-1 mL·L-1甲酸為流動相進(jìn)行梯度洗脫，同時檢測草香胃康膠囊中7種成分的含量。

本實(shí)驗(yàn)建立了能同時測定草香胃康膠囊中7種成分含量的HPLC法，該方法結(jié)果準(zhǔn)確、操作便捷，并對含量測定結(jié)果進(jìn)行了聚類分析，有利于藥品生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門不斷提升草香胃康膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，完善制劑生產(chǎn)所用原藥材的來源及內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，確保藥品臨床療效一致性，為全面、科學(xué)地評價草香胃康膠囊的整體質(zhì)量提供參考。