一測多評法測定固本統(tǒng)血顆粒中7種成分的含量

張榮華，王桂紅，殷 杰

(1.武漢市黃陂區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，武漢 430300；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065)

紫斑是因血絡(luò)受損，血溢于肌膚，以皮膚出現(xiàn)青紫斑點(diǎn)或斑塊、撫之不礙手為特征的出血性疾病，多因熱毒竄絡(luò)、血熱妄行、脾虛氣不攝血、外傷等，使血不循經(jīng)、外溢肌膚而致[1]。根據(jù)臨床癥狀分為血熱型、陰虛型、氣虛型和瘀阻型。固本統(tǒng)血顆粒現(xiàn)收載于《中國藥典》2015年版一部[2]，由巴戟天、淫羊藿、枸杞、黃芪、黨參和肉桂等10味中藥材按照中醫(yī)藥“君臣佐使”配伍理論組方制成，主治畏寒肢冷、腰酸乏力、尿清便溏、皮下紫斑其色淡黯等因陽氣虛損、血失固攝所致紫斑或輕型原發(fā)性血小板減少性紫癜。

中成藥復(fù)方制劑是多成分的集合體，具有多靶點(diǎn)、整體性、協(xié)同作用等特點(diǎn)，原有的單一成分質(zhì)量評價模式已經(jīng)不能適應(yīng)現(xiàn)代中藥的發(fā)展，一測多評法(QAMS)利用中成藥復(fù)方制劑中各成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，建立內(nèi)參物與各成分間的相對校正因子(RCFs)，通過測定其中質(zhì)量穩(wěn)定、價廉易得的成分而達(dá)到多指標(biāo)成分的同時測定，有效規(guī)避了傳統(tǒng)多指標(biāo)成分質(zhì)量控制檢驗(yàn)成本過高、部分對照品不穩(wěn)定、價高不易得等不足。QAMS法既可應(yīng)用于同類型成分的同時測定，也可用于不同類型成分的測定[3-4]。固本統(tǒng)血顆粒現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對淫羊藿苷進(jìn)行了定量控制，暫未檢索到對該制劑進(jìn)行定量研究的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)中成藥復(fù)方制劑中醫(yī)配伍理論，結(jié)合中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則[5]，選取質(zhì)量穩(wěn)定、價廉易得的主要藥效成分淫羊藿苷為內(nèi)參物，采用QAMS法對固本統(tǒng)血顆粒中水晶蘭苷、去乙酰基車葉草苷酸、車葉草苷酸、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ和東莨菪苷含量進(jìn)行同時測定，建立了固本統(tǒng)血顆粒多指標(biāo)成分的質(zhì)量評價模式，為全面評價固本統(tǒng)血顆粒的整體質(zhì)量奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀和Agilent Zorbax SB-C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，均購自美國Agilent公司；UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；ME204E型電子分析天平(德國梅特勒-托利多公司)；Phenomenex C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Phenomenex公司)；Waters Symmetry C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Waters公司)；KQ-400KDE型超聲波清洗器(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.2試藥 水晶蘭苷(批號111870-201303，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.3%)、淫羊藿苷(批號110737-201516，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.2%)和寶藿苷Ⅰ對照品(批號111852-201603，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%)，均購自中國食品藥品檢定研究院。去乙酰基車葉草苷酸(批號PRF8032242，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.8%)、車葉草苷酸(批號PRF8050928，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.2%)、朝藿定A(批號15042107，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.1%)和東莨菪苷對照品(批號PRF8042028，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.4%)，均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑為分析純；固本統(tǒng)血顆粒(規(guī)格：20 g·袋-1，批號分別為：20190601、20190819、20191010)，株洲千金藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃。乙腈(A)-2 mL·L-1磷酸(B)為流動相，梯度洗脫(0～14.0 min，18.0%A；14.0～26.0 min，18.0%A～23.0%A；26.0～39.0 min，23.0%A～58.0%A；39.0～47.0 min，58.0%A～75.0%A；47.0～55.0 min，75.0%A～18.0%A)。流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：235 nm(0～26.0 min檢測水晶蘭苷、去乙酰基車葉草苷酸和車葉草苷酸)[6-9]，270 nm(26.0～39.0 min檢測朝藿定A、淫羊藿苷和寶藿苷Ⅰ)[10-20]，346 nm(39.0～55.0 min檢測東莨菪苷)[21-23]；進(jìn)樣量：10 μL；理論塔板數(shù)按照各成分色譜峰計(jì)算均不小于3 500。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品儲備液 精密稱取7種成分對照品各適量，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇制成質(zhì)量濃度分別為1.498、0.674、0.156、0.618、1.794、0.932、0.118 mg·mL-1的混合對照品儲備液。

2.2.2混合對照品溶液 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對照品儲備液2.5 mL，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇稀釋至50 mL，制得7種成分質(zhì)量濃度分別為74.9、33.7、7.8、30.9、89.7、46.6、5.9 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.3供試品溶液 取固本統(tǒng)血顆粒適量，將內(nèi)容物研細(xì)，精密稱取3.0 g，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲(功率：400 W，頻率：40 kHz)提取30 min，放冷后用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，即得。

2.2.4陰性樣品溶液 按照固本統(tǒng)血顆粒的處方工藝分別制備缺巴戟天、淫羊藿和枸杞的陰性樣品，再按照2.2.3項(xiàng)下方法分別制成陰性樣品溶液。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專屬性實(shí)驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下制備的混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。由圖1可知，供試品溶液色譜圖中7種成分色譜峰峰形對稱，分離度均大于1.5；陰性樣品對固本統(tǒng)血顆粒中7種成分的定量測定無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 HPLC圖A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.巴戟天陰性樣品溶液；D.淫羊藿陰性樣品溶液；E.枸杞陰性樣品溶液；1.水晶蘭苷；2.去乙酰基車葉草苷酸；3.車葉草苷酸；4.朝藿定A；5.淫羊藿苷；6.寶藿苷Ⅰ；7.東莨菪苷。Fig.1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance solution；B.sample solution；C.Morindae officinalis Radix negative sample solution；D.Epimedii folium negative sample solution；E.Lycii fructus negative sample solution；1.monotropein；2.deacetylasperulosidic acid；3.asperulosidic acid；4.epimedin A；5.icariin；6.baohuosideⅠ；7.scopolin.

2.3.2線性關(guān)系考察 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對照品儲備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇稀釋至20 mL，制成系列混合對照品溶液1～6，檢測7種成分的峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，見表1。

表1 7種成分的線性關(guān)系和范圍Tab.1 Linearity and ranges of 7 components

2.3.3精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得7種成分峰面積的RSD值分別為0.63%、0.88%、1.12%、1.09%、0.57%、0.71%、1.16%，表明儀器精密度良好。

2.3.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批固本統(tǒng)血顆粒，按照2.2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣檢測7種成分色譜峰的峰面積，計(jì)算得各成分含量的RSD值分別為1.04%、1.17%、1.35%、1.29%、0.96%、1.10%、1.41%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.3.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液，于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣檢測7種成分色譜峰的峰面積，測得各成分峰面積的RSD值分別為0.59%、0.97%、1.08%、1.15%、0.54%、0.77%、1.21%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6回收率實(shí)驗(yàn) 取7種成分含量已知的固本統(tǒng)血顆粒9份，每份1.5 g，根據(jù)《中國藥典》2015年版四部要求，分別按照已知含量的50%、100%、150% 3個水平精密加入混合對照品溶液(7種成分質(zhì)量濃度分別為0.569、0.247、0.059、0.221、0.617、0.341、0.039 mg·mL-1)1.0、2.0、3.0 mL，各3份，再按照2.2.3項(xiàng)下方法制備加樣供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，計(jì)算7種成分的平均回收率。結(jié)果7種成分的平均回收率(RSD值)分別為99.67%(0.72%)、98.73%(1.06%)、96.98%(1.18%)、97.94%(1.25%)、100.14%(0.69%)、99.10%(0.75%)、97.37%(1.47%)。

2.4RCFs的測定及耐用性考察

2.4.1RCFs的測定 以淫羊藿苷為內(nèi)參物，精密吸取2.3.2項(xiàng)下制備的系列混合對照品溶液1～6，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測7種成分的峰面積，按照公式：RCFR/S=fR÷fS=(AS×CR)÷(AR×CS)(式中AS表示內(nèi)參物峰面積，CS表示內(nèi)參物質(zhì)量濃度，AR表示其他成分峰面積，CR表示其他成分質(zhì)量濃度)，分別計(jì)算6種成分的RCFs，結(jié)果見表2。

表2 以淫羊藿苷為內(nèi)參物的6種成分的RCFs Tab.2 RCFs of the other 6 constituents with icariin as an internal standard

2.4.2不同儀器、色譜柱對RCFs的影響 以淫羊藿苷為內(nèi)參物，精密吸取2.2.2項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定7種成分的峰面積，對比考察UltiMate 3000型、Agilent 1100型高效液相色譜儀及Agilent Zorbax SB-C18、Phenomenex C18、Waters Symmetry C183種型號色譜柱對RCFs的影響，結(jié)果見表3。

表3 不同儀器、色譜柱對RCFs的影響Tab.3 Influences of different instruments and columns on RCFs

2.4.3不同柱溫對RCFs的影響 以淫羊藿苷為內(nèi)參物，精密吸取2.2.2項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定7種成分的峰面積，對比考察不同柱溫(28、29、30、31、32 ℃)對RCFs的影響，結(jié)果見表4。

表4 不同柱溫對RCFs的影響Tab.4 Influences of different column temperatures on RCFs

2.4.4不同流速對RCFs的影響 以淫羊藿苷為內(nèi)參物，精密吸取2.2.2項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定7種成分的峰面積，對比考察不同流速(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min-1)對RCFs的影響，結(jié)果見表5。

表5 不同流速對RCFs的影響Tab.5 Influences of different flow rates on RCFs

2.5待測化合物色譜峰的定位 以淫羊藿苷為內(nèi)參物，精密吸取2.2.2項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄7種成分色譜峰的保留時間，采用相對保留時間值(RRT)法對待測化合物色譜峰進(jìn)行定位，結(jié)果見表6。

表6 不同儀器、色譜柱對RRT的影響Tab.6 Influences of different instruments and columns on RRT

2.6QAMS法與外標(biāo)法(ESM)測定結(jié)果比較 取3批固本統(tǒng)血顆粒，按照2.2.3項(xiàng)下方法每批平行制備供試品溶液3份，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定7種成分的峰面積，分別采用ESM法和QAMS法計(jì)算7種成分的含量，結(jié)果見表7。

表7 固本統(tǒng)血顆粒中7種成分的含量測定結(jié)果 (n=3)Tab.7 The content determination results of 7 components in Guben Tongxue Granules (n=3)

3 討論

3.1目標(biāo)化合物的選擇 固本統(tǒng)血顆粒由巴戟天、淫羊藿、枸杞、黃芪、黨參和肉桂等10味中藥制成，方中淫羊藿溫補(bǔ)腎陽，黃芪補(bǔ)氣升陽、生津養(yǎng)血，合為君藥；巴戟天、鎖陽補(bǔ)腎陽、益精血，菟絲子補(bǔ)益肝腎，黨參健脾益肺、養(yǎng)血生津，山藥補(bǔ)脾養(yǎng)胃、補(bǔ)腎生津，共為臣藥；枸杞滋補(bǔ)肝腎，為佐藥；附子善入氣分而散寒止痛，肉桂善入血分而溫經(jīng)通脈，溫腎助陽、溫經(jīng)散寒止痛，同時肉桂引藥于足少陰腎經(jīng)，為使藥，諸藥共奏，以達(dá)溫補(bǔ)脾腎、益氣止血之功。朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ等黃酮類化合物為君藥淫羊藿的主要有效成分；水晶蘭苷、去乙酰基車葉草苷酸、車葉草苷酸等環(huán)烯醚萜類成分為臣藥巴戟天的活性成分；東莨菪苷為佐藥枸杞的香豆素類代表性成分。本實(shí)驗(yàn)參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，選取上述7種化合物作為定量測定的目標(biāo)化合物，以期更加全面地評價固本統(tǒng)血顆粒的質(zhì)量。

3.2供試品溶液制備方法的選擇 考慮到固本統(tǒng)血顆粒處方中10味中藥材均經(jīng)過提取、濃縮后入藥，所含成分較易被提取，參考相關(guān)文獻(xiàn)，首先在超聲[6-8，11-15，24]提取60 min的條件下對比考察了不同提取溶劑(體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇[6-7]、甲醇[22，25-26]、體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇[8，12-13，18]和體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇[11，14，16])對7種成分綜合提取率的影響，結(jié)果以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇作為提取溶劑時，各成分綜合提取率最佳；同時為縮短供試品溶液的制備時間，降低雜質(zhì)成分對檢測結(jié)果的影響，又分別對不同超聲提取時間(15、30、60 min)進(jìn)行對比考察，最終確定采用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇超聲提取30 min作為固本統(tǒng)血顆粒供試品溶液的制備方法。

本實(shí)驗(yàn)采用QAMS法對固本統(tǒng)血顆粒中7種成分的含量進(jìn)行了同時測定，該方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，較傳統(tǒng)多組分質(zhì)量控制模式降低了檢驗(yàn)成本，有利于普及應(yīng)用，為全面評價固本統(tǒng)血顆粒的質(zhì)量提供了參考，同時通過對該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升，有助于藥品生產(chǎn)企業(yè)不斷完善原藥材的內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及制劑生產(chǎn)過程的參數(shù)控制，確保產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效的一致性和有效性。