頂空氣相色譜法測定甲鈷胺原料藥的7種溶劑殘留

顧曉風，田沛霖

(蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215104)

甲鈷胺又稱甲基維生素B12，是維生素B12在體內的活性形式之一。甲鈷胺為抗周圍神經病變藥，通過促進核酸和蛋白質的合成，恢復神經軸突傳遞的延遲和神經傳遞物質的減少，臨床主治由糖尿病引起的神經障礙、多發性神經炎，尤其對糖尿病并發癥，如麻木、疼痛及麻痹有明顯的效果[1-3]。

甲鈷胺以氰鈷胺為原料，在其生產過程中，經大孔樹脂吸附提純，普遍采用XAD1180大孔樹脂[4]，屬于苯乙烯骨架型，可能引入正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯等殘留[5-6]，后用丙酮進行重結晶，可能引入丙酮殘留。甲鈷胺收錄于《中國藥典》2020年版二部中，但未對其殘留溶劑進行規定[7]。甲鈷胺的進口藥品注冊標準JX20040191規定了丙酮的測定方法[8]，所用溶劑α-甲氧基乙醇毒性大，且僅特定品牌對丙酮測定無干擾；直接進樣峰形較差，樣品中的甲鈷胺殘留在分流平板上易造成污染。文獻報道[9-10]，目前尚未對甲鈷胺多種溶劑殘留，特別是大孔樹脂殘留進行系統地研究。按照人用藥品注冊技術國際協調會(ICH)及《中國藥典》的相關要求，采用大孔樹脂吸附凈化時，需對樹脂殘留進行檢測[11]。為確保原料藥的安全、有效和可控，本文采用頂空氣相色譜法，擬對甲鈷胺原料藥中的丙酮、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、二乙烯苯和苯乙烯7種溶劑進行檢測[12-19]，為甲鈷胺及其制劑的質量標準提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 7890B/7697A型頂空氣相色譜儀，Agilent DB-WAX(30 m×0.32 mm，0.5 μm)石英毛細管柱，安捷倫科技(中國)有限公司；XS205DU型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2試藥N，N-二甲基甲酰胺(色譜純，德國默克公司)；丙酮、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；水為去離子水(密理博公司)；7批甲鈷胺原料藥，分別由衛材(中國)藥業有限公司(批號分別為181252、181253、190451、190551、200453)和河北華榮制藥有限公司(批號分別為190118-02、191219-05)生產。

2 方法與結果

2.1色譜條件 采用Agilent DB-WAX(30 m×0.32 mm，0.5 μm)石英毛細管柱。程序升溫，起始溫度為40 ℃，保持5 min，以10 ℃·min-1的速率升至180 ℃，保持5 min。進樣口溫度為220 ℃，分流比為2∶1。檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID)，溫度為250 ℃。載氣為高純氮，流速為1.5 mL·min-1。頂空平衡溫度為80 ℃，平衡時間為30 min，定量環溫度為95 ℃，傳輸管溫度為110 ℃，進樣時間為1 min。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品儲備液 精密稱取苯、正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯和丙酮適量，加質量濃度為100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋成質量濃度分別為4.06、40.16、40.72、39.92、10.79、10.02、1 022.46 μg·mL-1的混合溶液。精密移取上述混合溶液10 mL，加水稀釋至100 mL，搖勻，即得。

2.2.2混合對照品溶液 精密吸取2.2.1項下制備的混合對照品儲備液10 mL，置于100 mL量瓶中，加質量濃度為100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液稀釋至刻度，搖勻，移取5 mL置于頂空瓶中，加蓋密封，即得。

2.2.3供試品溶液 精密稱取甲鈷胺0.1 g，置于頂空瓶中，精密加入質量濃度為100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液5 mL，加蓋密封，超聲(500 W，40 kHz)處理1 min使溶解，即得。

2.2.4空白溶液 精密移取質量濃度為100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液5 mL，置于頂空瓶中，加蓋密封，即得。

2.3專屬性考察 取2.2項下制備的空白溶液、混合對照品溶液和供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進行測定，色譜圖見圖 1。由圖1可知，空白溶液無干擾，混合對照品溶液中，各峰的理論塔板數均大于5 000，拖尾因子均小于1.5，分離度大于2.0，符合分析要求。其中二甲苯出峰峰號5、6、7、8，二乙烯苯出峰峰號10、11、12、13，定量以各峰面積之和計算[20]。

圖1 GC圖A.空白溶液；B.混合對照品溶液；C.供試品溶液；1.正己烷；2.丙酮；3.苯；4.甲苯；5、6、7、8.二甲苯；9.苯乙烯；10、11、12、13.二乙烯苯。Fig.1 GC chromatogramsA.blank solvent；B.mixed reference substance solution；C.sample solution；1.hexane；2.acetone；3.benzene；4.toluene；5，6，7，8.xylene；9.cinamene；10，11，12，13.divinyl benzene.

2.4精密度考察 取2.2.2項下制備的混合對照品溶液6份，按照2.1項下色譜條件進行測定。結果7種溶劑峰面積的RSD值分別為2.68%、0.30%、2.01%、1.82%、1.79%、1.50%、1.62%，表明儀器精密度良好。

2.5線性關系考察 精密移取2.2.1項下制備的混合對照品儲備液20、10、5、2、1 mL，分別置于100 mL量瓶中，加質量濃度為100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液稀釋至刻度，搖勻。精密移取上述系列溶液各5 mL，置于頂空瓶中，密封。按照2.1項下色譜條件進行測定，以質量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線，見表1。

2.6定量限和檢測限 取2.2.1項下制備的混合對照品儲備液，逐級稀釋，測定并記錄峰面積，當信噪比為10∶1時，得到定量限(LOQ)；信噪比為3∶1時，得到檢測限(LOD)。結果見表1。

表1 回歸方程、線性范圍、LOD與LOQTab.1 Regression equations，linear ranges and LOD and LOQ

2.7回收率實驗 精密移取2.2.1項下制備的混合對照品儲備液7.5、5.0、2.5 mL，分別置于100 mL量瓶中，加質量濃度為100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液稀釋至刻度，搖勻。精密稱取甲鈷胺(批號190451)9份，每份0.1 g，分別置于頂空瓶中，每3份為1組。3組分別精密加入上述3種溶液各5 mL，加蓋密封，超聲(500 W，40 kHz)處理1 min使溶解，按照2.1項下色譜條件進行檢測，計算平均回收率，結果見表2。

表2 回收率實驗結果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests (n=9)

2.8樣品含量測定 取7批樣品，按照2.2.3項下方法制備供試品溶液后進行測定，以外標法計算樣品中殘留溶劑的含量，結果見表 3。

表3 樣品含量測定結果Tab.3 Determination results of sample content

3 討論

3.1溶劑的選擇 甲鈷胺在水中微溶，而正己烷、苯和苯乙烯等有機溶劑在水中幾乎不溶，添加N，N-二甲基甲酰胺能提高這些溶劑在水中的溶解度。N，N-二甲基甲酰胺質量濃度過低時，有機溶劑可能析出，影響準確度；N，N-二甲基甲酰胺質量濃度過高時，會影響蒸氣壓，造成頂空進樣，影響靈敏度。經考察，選用質量濃度為100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液作為溶劑，結果重復性好，大部分有機溶劑響應值高，靈敏度滿足要求。

3.2色譜柱的選擇 比較了中等極性毛細管柱Agilent DB-1701(30 m×0.32 mm，0.5 μm)和極性毛細管柱Agilent DB-WAX(30 m×0.32 mm，0.5 μm)，結果表明，極性毛細管柱Agilent DB-WAX(30 m×0.32 mm，0.5 μm)更好地實現二甲苯與二乙烯苯多個峰之間的完全分離。

3.3頂空條件的選擇 考察頂空平衡溫度，溫度設置為70、80、90 ℃。結果表明，當溫度為70 ℃時，高沸點物質峰面積小，靈敏度較差；當溫度為80 ℃時各峰的峰面積重復性好，峰響應較好；溫度80、90 ℃之間無顯著差異，故選擇80 ℃作為頂空平衡溫度。

分別考察了頂空平衡時間為15、30 min，結果表明，平衡時間為30 min時，各峰峰面積更加穩定，故選擇30 min作為頂空平衡時間。

4 小結

參考《中國藥典》2020年版、甲鈷胺進口注冊標準JX20040191及ICH有關規定，本文控制7種溶劑的殘留限度分別為不得超過0.05%、0.002%、0.000 2%、0.002%、0.002%、0.000 5%、0.000 5%。本文建立了甲鈷胺中7種殘留溶劑的頂空氣相色譜法，對收集到的7批樣品進行測定，其中2批樣品檢測出樹脂殘留，5批檢測出丙酮殘留，結果均在限度范圍內。該方法操作簡單，靈敏度高，可用于甲鈷胺殘留溶劑的質量控制。