牛乳中嗜冷菌產耐熱酶的研究進展

鄧應旺，韓雪，涂遠強，王宇

哈爾濱工業大學化工與化學學院黑龍江（哈爾濱 150001）

牛乳中含有豐富的蛋白質、礦物質等物質，營養價值極高，被營養學家譽為“白色血液”而備受青睞[1]。牛乳的pH接近中性并且水分含量高，故牛乳也是一種優良的微生物培養基質，極其適于微生物的生長繁殖[2]。雖然鮮牛乳通常被認定為是無菌的，但是擠奶和貯藏運輸等過程易被微生物污染。隨著冷鏈運輸技術的普遍采用，牛乳中的嗜溫微生物生長停滯，而嗜冷菌選擇性地生長成為牛乳中的優勢菌。

嗜冷菌是一類在0～5 ℃可以生長，最適生長溫度一般不超過15 ℃，但最高生長溫度可以高于20 ℃的微生物[3-4]。嗜冷菌種類繁多，從新鮮牛乳中最常分離到的是不動桿菌屬（Acinetobacter）、無色桿菌屬（Achromobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、產堿桿菌屬（Alcaligenes）、腸桿菌屬（Enterobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、假單胞菌屬（Pseudo-monas）和沙雷菌屬（Serratia），其中假單胞菌屬是最主要的菌屬[5]。嗜冷菌是低溫貯藏牛乳中最活躍的一類微生物，與嗜溫微生物相比，其細胞膜組成成分有所不同，其中含有大量的多不飽和脂肪酸，熔點降低，使細胞膜在低溫下能有良好的流動性[6]；此外，嗜冷菌中還含有抗凍蛋白和冷休克蛋白[7]，這些能幫助嗜冷菌更好的在低溫下生長，并且嗜冷菌中參與代謝的酶所需活化能較低，催化效率高[8]，這都給它適應低溫創造良好條件。

液態牛乳主要分為兩類，一類是巴氏殺菌乳，另一類是UHT乳。這兩類乳均采用熱處理的方式進行滅菌。雖然熱處理能有效殺滅嗜冷菌，但是嗜冷菌在低溫環境下分泌的酶高度耐熱，經過高溫熱處理仍然殘留活性且在牛乳貯藏期間通過分解蛋白質和脂肪導致牛乳發生沉淀、凝膠和變味，造成發酵產品品質缺陷，進而影響產品貨架期[9]。近年來，隨著膜分離技術的成熟，由于它具備運行溫度低、不易相變、可避免由熱加工帶來的乳營養損失等優點，是一種安全的冷殺菌技術而受到越來越多乳制品加工企業的青睞。北京三元極致ESL乳就是利用微濾殺菌的乳制品。雖然膜分離通過截留微生物保證乳品的安全性，但是由于嗜冷菌所產耐熱酶分子質量較小，不能被有效截留而殘留到乳中，造成乳制品保藏過程中變質。因此無論是熱殺菌還是冷殺菌，對牛乳中的嗜冷菌及其產生的耐熱酶進行研究并找出切實可行的控制方法十分重要。

1 嗜冷菌的分布及多樣性

地球上有80%左右的表面處于15 ℃以下，深海地區、高寒地區、永久凍土地區及極地地區占據地球的絕大部分[10]，這些低溫地區都為嗜冷菌提供基本的生長繁殖環境。嗜冷菌分布廣泛，有研究相繼從海洋[11]、北極[12]、南極洲[13]、龍蝦肌肉[14]中分離到嗜冷菌，在牛乳中分離到的嗜冷菌主要是假單胞菌屬[15]。

身體狀況良好的奶牛分泌的牛乳一般被認為是無菌的，因此牛乳中的嗜冷菌主要來自于外部環境，它們的種類和數量也因貯運溫度、地域因素、季節因素和貯藏時間變化而變化。Izidoro等[16]研究發現，隨著貯存溫度升高，嗜冷菌數量也隨之增加，因此嚴格控制低溫貯運能有效減少嗜冷菌數量。Hantsis-Zacharov等[17]研究來自以色列北部4個不同農場的原料乳經冷藏后可培養嗜冷菌的多樣性，結果發現樣品中主要的嗜冷菌為相同菌屬，但每種樣品的菌群結構并不相同。Kable等[18]比較春、夏和秋三季采集的牛乳的菌群結構，結果發現春季樣品中微生物的多樣性指數最高，并且認為降雨可能是導致該現象出現的原因。但是，冬季的牛乳中嗜冷菌在微生物菌群中所占比例最高，春秋季節稍低，夏季最低[19]。有研究發現，原料乳在4 ℃條件下貯存時間的延長會導致Pseudomonasspp.和一些Bacillusspp.數量的增加[20]。直接從乳房分泌出來的牛乳中主要是革蘭氏陽性的嗜中溫需氧菌，只有10%是嗜冷菌，冷藏1 d后，嗜冷菌的含量可增加到微生物總量的50%；冷藏2 d后，嗜冷菌可達到微生物含量的90%以上[5]。由此可見，牛乳從分泌到加工這段時間越短越好，能有效減少嗜冷菌數量增加。

2 嗜冷菌產生的蛋白酶和脂肪酶及其危害機制

嗜冷菌菌體本身對牛乳的危害有限，經過熱處理，嗜冷菌基本不能存活，但是其在低溫條件下分泌的酶具有高度耐熱性，經過巴氏殺菌甚至經過UHT處理依然能保持一定活性，在牛乳的后續貯藏中分解蛋白質、脂肪等物質，影響牛乳風味，破壞牛乳質地，造成腐敗變質。

2.1 蛋白酶對牛乳的影響

牛乳中的蛋白酶包括：乳自身的纖維蛋白溶酶和由嗜冷菌產生的耐熱蛋白酶，其中纖維蛋白溶酶在生乳中主要以無活性的酶原形式存在，經過熱處理幾乎完全失活；而嗜冷菌產生的蛋白酶經過UHT處理仍殘留一部分的活性。嗜冷菌產生的蛋白酶有胞內、胞壁和胞外蛋白酶，當菌體被殺死后，胞內和胞壁蛋白酶釋放到乳中影響產品的品質。研究主要集中于嗜冷菌產的胞外蛋白酶上，尤其是假單胞菌屬所產的胞外蛋白酶。

2.1.1 胞外蛋白酶的熱穩定性

嗜冷菌分泌的胞外蛋白酶多為堿性金屬蛋白酶，Zn2+和Ca2+構成其酶活中心，相對分子質量多為40～50 kDa，一般出現在對數生長末期，最適生長溫度30～40℃、pH 6～8，大多數嗜冷菌產生的胞外蛋白酶具有良好耐熱性，在140 ℃下的D值為2～300 s[21]。純化后的蛋白酶在乳中比在水中有更高的穩定性，乳脂肪的存在會增加蛋白酶的耐熱性[22]，且乳脂對蛋白水解有促進作用。Dong等[15]研究發現，對于乳脂對蛋白水解活性的影響，有這樣幾種可能的解釋：脂肪會影響假單胞菌的代謝，刺激酶的產生；脂肪會影響蛋白酶釋放的形態，蛋白酶更多地暴露活性位點，使其更容易水解蛋白質；水乳狀液似的脂肪可以協助蛋白水解酶與其底物之間的疏水相互作用，可能增加活性位點和肽鍵之間的可達性，促進蛋白酶活性。此外，Chunyue等[23]發現AprX的熱穩定性主要歸功于其靈活的三級結構，當溫度再次降低時，它可以通過鈣鹽橋的形成快速準確地重新折疊。鈣存在時，蛋白酶AprX的耐熱性也隨之提高。

研究發現，蛋白酶在乳中具有較強的復原活性，經過高溫熱處理，未徹底失活的蛋白酶在溫度降低后再次復原成能分解蛋白質的結構，這一特性決定一旦牛乳中原始蛋白酶數量過多，單一的熱處理方式將不能有效抑制蛋白酶[24]。此外，雖然胞外蛋白酶有良好的耐熱性，但多數嗜冷菌蛋白酶也具有低溫失活現象，即蛋白酶在40～70 ℃熱處理較為敏感，這可能是由酶分子間的自我水解引起的[25]。

2.1.2 胞外蛋白酶對牛乳的危害

蛋白酶是一類水解酶，它催化蛋白質水解成氨基酸。嗜冷菌在低溫時大量分泌蛋白酶，經過巴氏殺菌和UHT處理，嗜冷菌被滅活但蛋白酶耐高溫能持續影響牛乳的質量。在UHT乳中，陳化膠凝是最常見的質量缺陷問題，以貯存過程中牛乳的流動性損失為特征，牛乳的黏度在較長時間內保持恒定，有時甚至稍有降低；之后黏度陡然提高（成熟稠化），并且不久便形成不能再分散的凝膠。凝膠有多種不同類型，從弱而透明的膠凝狀態到似凝乳酶凝乳的膠凝狀態。

陳化膠凝是一個純粹的物理-化學凝聚過程，即使產品己形成像凝乳酶凝塊似的凝膠，它仍可能是無菌狀態。對陳化膠凝化的機理有兩種解釋，有學者認為在牛乳貯存期間發生的陳化膠凝現象是由乳中殘留的蛋白酶活性造成的：乳蛋白被蛋白酶水解，通過形成肽來促進老化凝膠化[26]。乳中的蛋白酶來源有2種：一是嗜冷菌產生的蛋白酶；二是乳中內源性蛋白酶即纖溶酶系，這種酶也能在UHT處理中活下來[27]。也有學者認為牛乳膠凝化老化是一種非酶或物理化學變化，在此過程中沒有觀察到蛋白質的降解，但這一過程速度較慢，通常需要超過12個月的時間[28]。基于此，Zhang等[29]研究蛋白酶AprX和血纖維蛋白溶酶對牛乳的影響，為減少非酶物理化學變化的干擾，通過在較短的時間內加入高濃度的酶來進行相關研究，得出蛋白酶AprX和血纖維蛋白溶酶都能導致牛乳陳化膠凝化，但機制有所不同，AprX主要是通過水解κ-酪蛋白形成副κ-酪蛋白，使κ-酪蛋白無法發揮穩定蛋白質的性能，導致蛋白質集中，最后蛋白質在重力作用和Ca2+作用下逐漸沉到底部，這個過程中乳清不斷排出，出現凝膠。而血纖維蛋白溶酶則是通過水解β-酪蛋白和α-酪蛋白，導致γ-酪蛋白含量升高形成軟凝膠破壞牛乳質量。

UHT乳在貨架期內還會出現澀味、苦味等風味的變化。UHT乳中殘留的耐熱蛋白酶水解乳蛋白形成氨基酸和短肽所致，這些短肽和氨基酸殘基（蘇氨酸等）自身帶有苦味，影響產品口味。蛋白水解的發展所導致的牛奶產生苦味，這是陳化凝膠現象可能發生的一個重要特征。

2.2 脂肪酶對牛乳的影響

乳脂肪被分泌于乳脂肪球的一個單一結構，乳脂肪球由一個包含96%～97%的三酰基甘油的核組成，被磷脂和蛋白質層包裹。為了受到脂解酶的作用，三酰基甘油必須通過脂肪球薄膜的分解釋放到水相。三酰基甘油被脂肪酶水解產生自由脂肪酸，以此產生不良風味如酸臭味、辛辣味、苦味、澀味等，使牛乳及其衍生物不可食用[30]。

牛乳的水解酸敗主要是由于其中的脂肪酶水解乳脂肪造成的。牛乳中的脂肪酶主要有兩種來源，一種是牛乳自身含有的脂蛋白酯酶，另一種是牛乳中污染的微生物產生的脂肪酶。脂蛋白酯酶在乳中含量很低、不耐高溫，75 ℃、5 min或65 ℃、20 min的熱處理或254 nm下紫外線照射30 min可使其失活[31]。脂蛋白脂酶的熱穩定性較差，經過熱處理基本被滅活，因此主要是對殺菌前的牛乳有影響。牛乳中微生物產生的脂肪酶主要來源于嗜冷菌所產的脂肪酶，這類脂肪酶高度耐熱，即使經過UHT處理仍能殘留20%～30%的活性[32]。殘留的脂肪酶在后續牛乳的貯藏中持續進行破壞，分解脂肪成脂肪酸，導致牛乳酸敗。

脂肪酶是甘油三酯酰基水解酶，是一種絲氨酸水解酶。脂肪酶除水解三酰基甘油外，還能夠催化酯化反應、酯交換、酸解、醇解及氨解等。一些嗜冷菌分泌的脂肪酶經過高溫處理能夠保持大部分活力，有的脂肪酶在150 ℃時的D值（酶活性減少90%所需的時間）達到290 s[33]。與牛乳中的脂蛋白脂肪酶相比，嗜冷菌產生的脂肪酶能夠對包裹在脂肪球外的脂肪球膜進行破壞，使其失去對脂肪的保護作用，嚴重破壞原料乳和乳制品中的脂肪[34]。由于脂肪球膜被破壞，脂肪球失去穩定性，粘在一起，嚴重時表現出脂肪上浮。同時，脂肪被分解釋放出的游離脂肪粘合，互相碰撞的脂肪球形成脂肪球簇，也會導致乳中脂肪上浮[35]。Zhang等[36]研究發現將UHT乳進行加熱和均質，均質作用使天然乳脂肪球機械破碎成更小的顆粒，之后天然乳脂肪球膜不足以覆蓋較大的脂肪球表面積。因此，脂肪球的表面被吸附的牛奶蛋白所覆蓋和穩定，主要是酪蛋白，可將其稱為脂肪表面吸附蛋白（FSAP）。而耐熱性的蛋白酶能夠水解α-酪蛋白和β-酪蛋白，破壞乳脂肪球和酪蛋白表面結構，引起脂肪與脂肪、脂肪與酪蛋白結合并聚集，形成小的薄片浮于乳的上部[37]。

UHT乳中殘留的耐熱脂肪酶對乳脂肪的水解產生脂肪氧化味，特別是水解產生的一些游離脂肪酸具有不良風味。因此，控制UHT乳中殘留脂肪酶和蛋白酶的含量可有效抑制UHT乳貯存期間的脂肪和蛋白水解，從而有效防止UHT乳貯存期間風味的改變。

3 嗜冷菌及其耐熱酶的控制

牛乳中的嗜冷菌及其耐熱酶短期內無法找到合適的方法去徹底消滅，但可以采取一些方法來適當控制嗜冷菌的生長以降低損失。1）控制原料乳中的嗜冷菌數量。中國現行國標GB 19301—2010規定生乳的微生物含量≤2×106CFU/mL。有研究發現，原料乳中一定數量的嗜冷菌（106CFU/mL）不適宜長期UHT乳（保質期9個月），但在制作奶酪時對奶酪令人滿意的風味和芳香有益[38]。在衛生條件良好的情況下，在取自健康奶牛的新鮮生奶中，嗜冷菌的數量少于102CFU/mL，但是原料乳從分泌到加工通常需要一定時間，這段時間有利于嗜冷菌生長[39]。Dong等[40]研究發現，原料乳在7 ℃冷藏時嗜冷菌數量每天以10 CFU/mL增長，經過UHT處理之后，原料乳中原始細菌數量越多，蛋白水解程度越快。因此，應盡量縮短原料乳從分泌到加工這段時間以減少嗜冷菌的原始數量。2）深度冷藏。相同的原料乳在2 ℃儲存比在4 ℃儲存生產出的UHT乳保質期更長，可采用深度冷藏的方法減少嗜冷菌及其代謝產物的產生[41]。3）低溫鈍化。將原料乳或UHT牛乳在55 ℃下熱處理60 min通常能夠使產品中的蛋白水解酶活性顯著降低。然而，將低溫鈍化應用于實際生產中會有很多麻煩，其中最重要的是來源于不同微生物的蛋白酶表現出不同的鈍化溫度，從50～60 ℃不等，由于這些溫度特異性非常強，所以除非了解每一批牛奶所污的染酶的特性，否則所選擇的低溫鈍化的條件將是無效的。4）利用加壓CO2。劉美鳳等[42]研究加壓CO2對熒光假單胞菌的殺菌效果，證明加壓CO2可以有效殺滅熒光假單胞菌并抑制蛋白酶的分泌。5）高壓均質。Oliveira等[43]研究發現，高壓均質能降低熒光假單胞菌蛋白酶造成的乳蛋白水解。對于含3%脂肪的牛乳，在100 MPa高壓均質處理下，蛋白水解程度降低29%，膠凝化出現的時間至少延遲23 d；在150 MPa高壓均質處理下，蛋白水解程度降低51%，膠凝化出現的時間至少延遲40 d。雖然高壓均質能減緩蛋白水解的速度，但不能鈍化嗜冷菌產生的蛋白酶，也不能降低脫脂乳中的蛋白水解程度。

目前最有效的方法依舊是控制原料乳中的原始嗜冷菌數量，縮短原料乳從分泌到加工的時間，有效減少微生物數量，相應地耐熱酶含量也降低，這能有效保證乳及乳制品的質量。

4 結語與展望

嗜冷菌及其產生的耐熱酶對牛乳的品質有很大影響，雖然對嗜冷菌及其耐熱酶進行廣泛研究并取得進展，許多學者也從牛乳中陸續分離出多種耐熱酶并對其進行酶學性質研究，但是尚沒有方法能徹底消滅牛乳中嗜冷菌產生的耐熱酶，并且與快速檢測牛乳中的耐熱酶及有效控制嗜冷菌耐熱酶的產生和活性仍有差距。