Serpin B9與腫瘤及腫瘤干細胞的研究進展

王文君，王 嬌，葉小群

中國全國腫瘤登記中心和美國癌癥協會的數據顯示，當前腫瘤新發病例數和死亡病例數均居高不下，給全世界的醫療和經濟均帶來沉重負擔[1-2]。因此，尋找腫瘤治療新靶點，研發抗腫瘤藥物一直是亟待解決的問題。腫瘤的發生和發展受多種因素的影響。有研究發現，腫瘤免疫逃逸能夠通過隱藏腫瘤細胞的免疫原性，逃避機體的免疫監管系統，從而促進腫瘤的發生和進展。因此，針對腫瘤免疫逃逸的免疫治療應運而生，而靶向程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）/ 程序性死亡受體-配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）通路治療是其中的主要代表[3]。此外，其他的免疫逃逸機制也逐漸受到學者的關注。

絲氨酸蛋白酶抑制劑B9（serine proteinase inhibitor，Serpin B9）是一種核質分布的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其基因定位于染色體6p25 區[4]。Serpin B9 的主要作用機制是抑制顆粒酶B（granzyme B）的殺傷作用，而顆粒酶B 主要由淋巴細胞脫顆粒釋放，可以發揮促細胞凋亡、抗病毒和抗腫瘤的作用。在腫瘤中，Serpin B9 能夠通過抑制顆粒酶B 對腫瘤細胞的殺傷而保護腫瘤細胞，從而發揮抗腫瘤細胞凋亡的作用[5]。最新的研究指出，敲除Serpin B9 基因后可使腫瘤細胞被顆粒酶B 所殺傷，而Serpin B9 抑制劑不僅能夠促進腫瘤細胞凋亡以及抑制腫瘤的生長，還能夠延長成瘤小鼠的生存時間[6]，提示Serpin B9 可能是一種新的腫瘤分子靶點。因此，本文從Serpin B9 的結構、功能及調控腫瘤組等方面，對Serpin B9 在腫瘤及腫瘤干細胞中的作用進行綜述。

1 絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族

絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族是一類具有共同來源、結構序列高度同源而功能高度分化的蛋白酶抑制劑超家族，最早在人血漿中被發現[7-8]，絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族廣泛存在于自然界中，包括細菌、真菌、植物和動物等，至今已鑒定超過1 000 種，按照共同的起源分為16 個亞組（A～P）。其中，在人類中發現13 個B 類亞組成員，即Serpin B1～Serpin B13[9]。絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族是一類單鏈蛋白，通常由350～500 個氨基酸組成，相對分子質量為（40～100）×103，其主要作用位點是蛋白酶識別域靠近其C 端的反應中心環（reactive center loop，RCL），裂解的RCL 與靶蛋白酶一起插入Serpin 的β-折疊A 中，引發Serpin 構象變化，形成穩定的共價復合物，最終導致靶蛋白酶失活[10]。研究發現，Serpin 能夠抑制與炎性反應、補體、凝血及免疫有關的蛋白酶，參與肺氣腫、肝硬化、血管性水腫、癡呆、糖尿病、病毒性肝炎、血栓及腫瘤等疾病的病理和生理過程[8]。近期有研究指出，Serpin B9 與人類腫瘤密切相關，能夠促進腫瘤的發生和發展，提示其可能成為腫瘤治療新靶點。

2 Serpin B9 的結構和功能

Serpin B9 最早是從人胎盤cDNA 文庫中篩選出來的，包含7 個外顯子和6 個內含子，編碼含有374 個氨基酸的單鏈蛋白，相對分子質量為42×103[4]。Serpin B9 具有高度保守的三級結構，包括9 個α 螺旋、3 個β 折疊以及羧基末端1 個功能活性反應中心RCL，該區域存在1 個特異的PI-PI’位點（一對高度保守的半胱氨酸），該位點的氨基酸殘基決定了蛋白酶抑制劑的特異性[11]。如前所述，Serpin B9 通過抑制顆粒酶B在機體內參與疾病的發生和發展。顆粒酶B 一般由細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和自然殺傷（natural killer，NK）細胞脫顆粒釋放，是CTL/NK 細胞誘導靶細胞凋亡的重要介質[5]。Serpin B9 能在RCL 中形成二硫鍵，阻止PI’鍵被顆粒酶B 裂解，抑制顆粒酶B 的殺傷作用而保護細胞[11-12]。Serpin B9 廣泛存在于人體各種組織中，包括血液、心臟、肺和肝臟，尤其是在胎盤和睪丸中，而卵巢和眼睛中也發現Serpin B9 高表達，能夠抑制顆粒酶B 的殺傷作用而發揮細胞保護作用[13]。Serpin B9 有特異的絲氨酸蛋白酶抑制劑屬性。越來越多的臨床研究表明，Serpin B9 也是一個頗有前景的疾病診斷及預后預測指標，例如診斷血栓形成或評估炎癥及病毒感染的預后[7,14]。

3 Serpin B9 與腫瘤

研究表明，腫瘤免疫逃逸是導致腫瘤發生和進展甚至治療失敗的原因之一。腫瘤的免疫逃逸是指盡管機體擁有正常的免疫監管系統，但是腫瘤仍然能夠保持異質性且持續生長、侵襲和轉移[15]。最早在T 細胞淋巴瘤中的研究發現，Serpin B9參與腫瘤的免疫逃逸，并且在不同程度上影響惡性淋巴瘤的免疫治療效果[16-17]。JIANG 等[6]研究證實，Serpin B9 能夠抑制顆粒酶B 對腫瘤細胞的殺傷作用而發揮保護腫瘤細胞的作用，上調Serpin B9 的表達能夠促進腫瘤的發展，而下調Serpin B9 的表達則能抑制腫瘤的發展，這與近年的臨床研究結果相一致。對生物信息學進行挖掘，結果提示Serpin B9 的表達與葡萄膜黑素瘤的不良預后相關[18]。同樣，間變大細胞淋巴瘤研究也發現，Serpin B9 的表達與臨床結局尤其是不良預后密切相關[19-20]。目前的大部分研究已證實，Serpin B9 對腫瘤具有保護作用；但也有部分研究未發現這一結果。一項結直腸癌研究發現，癌旁正常組織中Serpin B9 高表達與較好的預后相關[21]，但該研究是針對Serpin B9 在正常組織中的表達情況，而不是在腫瘤組織中的表達情況，因此不具有代表性。總之，目前的研究認為Serpin B9能夠調控腫瘤細胞凋亡和腫瘤的免疫逃逸，從而促進腫瘤的發生、發展、轉移和耐藥等過程。

3.1 Serpin B9 與腫瘤細胞凋亡

腫瘤的發生、發展、轉移和耐藥等都涉及腫瘤細胞凋亡。研究認為，Serpin B9 能夠保護腫瘤細胞，避免腫瘤細胞發生凋亡。肺癌相關研究指出，相較于低表達Serpin B9 的肺腺癌細胞，高表達Serpin B9 的肺腺癌細胞凋亡明顯減少，表明Serpin B9 有助于腫瘤細胞對抗凋亡[22-23]。同樣，高表達Serpin B9 的白血病細胞能夠抵抗顆粒酶B 誘導的細胞凋亡，因此研究者認為Serpin B9的表達及顆粒酶B 的活性能夠預測白血病的免疫治療效果[19]。除此之外，研究發現Serpin B9 在腫瘤細胞中的表達差異也對腫瘤細胞凋亡具有重要意義。在小兒急性淋巴細胞白血病患者中，白血病細胞中Serpin B9 的表達差異改變了顆粒酶B 和其他殺傷細胞對白血病細胞的敏感性，尤其是Serpin B9 過表達可明顯抑制移植物抗白血病效應[24]。近年來的研究還指出，Serpin B9 可能參與促進癌前病變進展為惡性腫瘤的過程。前列腺癌相關研究發現，過表達Serpin B9 能夠保護前列腺癌細胞而避免其凋亡，還有研究發現前列腺的炎性反應可能觸發Serpin B9 的表達上調，由此提示Serpin B9 在癌前病變階段或腫瘤早期均表達上調，使細胞在惡變早期免于發生凋亡，進而發展為腫瘤[25]。

Serpin B9 主要通過抑制顆粒酶B 抑制腫瘤細胞凋亡，而顆粒酶B 能夠通過多種機制介導腫瘤細胞凋亡。在NK/T 細胞非霍奇金淋巴瘤中，顆粒酶B 通過天冬氨酸酶依賴性和非天冬氨酸酶依賴性2 種機制誘導NK/T 細胞淋巴瘤細胞死亡，進而導致廣泛性壞死[26]。此外，在某些腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）敏感性腫瘤細胞系中，Serpin B9 能夠抑制TNF 及TNF 凋亡相關配體和Fas 配體介導的腫瘤細胞凋亡[27]。除了直接抑制顆粒酶B 發揮抗細胞凋亡作用以外，Serpin B9 還能協同其他的蛋白酶抑制劑抵御顆粒酶B 的殺傷作用。例如，參與抑制細胞毒性的絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine protease inhibitor involved in cytotoxicity inhibition，SPI-CI）能夠保護細胞免受穿孔素和（或）顆粒酶B 的殺傷。有研究指出，SPI-CI 可與Serpin B9 協同阻止細胞毒性淋巴細胞介導的腫瘤殺傷作用[28]。上述結果均表明，Serpin B9 可以通過各種機制保護腫瘤細胞而避免其凋亡，有望成為新的針對腫瘤細胞凋亡的分子靶點。

3.2 Serpin B9 與腫瘤免疫

免疫系統對于腫瘤而言表現出雙面性。一方面，腫瘤的免疫逃逸能夠促進腫瘤的發生和發展；另一方面，機體的免疫防御能夠殺傷腫瘤細胞甚至消滅腫瘤。Serpin B9 可能既參與了腫瘤的免疫逃逸，也參與了機體的免疫殺傷，在腫瘤免疫中扮演著復雜的角色。MEDEMA 等[29]發現，Serpin B9 表達上調是提示T 細胞免疫治療腫瘤失敗的重要參數。各類淋巴瘤研究結果均顯示，淋巴瘤細胞高表達Serpin B9 能夠引發機體的免疫紊亂，促進正常細胞發生惡變[30]。為更深入地研究Serpin B9，有研究采用慢病毒感染方法使Serpin B9 在人宮頸癌HeLa 細胞或人乳腺癌MCF-7細胞中過表達，結果發現高表達Serpin B9的腫瘤細胞的存活時間更長，提示Serpin B9 可能使其獲得了更強的抵抗免疫殺傷的能力[31]。除此之外，霍奇金淋巴瘤患者的研究結果提供了更加直觀的證據，即Serpin B9 能夠通過干擾免疫系統，幫助腫瘤細胞發生免疫逃逸的證據；大多數的經典霍奇金淋巴瘤細胞系均高表達Serpin B9，能夠對抗增強顆粒酶B 殺傷效應的免疫治療，從而促進淋巴瘤細胞發生免疫逃逸[32]。同樣，在乳腺癌和肺癌中也觀察到Serpin B9 能夠增強腫瘤細胞的免疫逃逸[23,33]。鑒于Serpin B9 的重要性，研究者在Serpin B9 陽性表達腫瘤（例如復發性霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和肺癌等）中構建了Serpin B9 不敏感識別顆粒酶B 的細胞系，以誘導顆粒酶B 殺傷腫瘤細胞，這或許能夠成為一種新的免疫療法[32]。臨床研究也發現了相同的結果，有研究結果顯示Serpin B9 的表達水平與腫瘤分期和不良預后呈正相關。例如，Serpin B9 在肺癌細胞中高表達，而肺癌細胞可以利用Serpin B9增強免疫逃逸效應，并且該作用隨肺癌分期的升高而明顯增強[34]。還有研究指出，Serpin B9 參與彌漫大B 淋巴瘤及霍奇金淋巴瘤的免疫逃逸，避免細胞毒性T 淋巴細胞介導的殺傷作用；生存分析結果提示，Serpin B9 也是不良預后的主要預測指標[35]。上述研究證據均表明，Serpin B9 能夠增加腫瘤的免疫逃逸，促進腫瘤的發生和發展，與腫瘤的不良預后密切相關。

3.3 Serpin B9 與腫瘤發生及腫瘤細胞增殖

研究發現，Serpin B9 能夠促進腫瘤發生，甚至在癌前病變中顯現出類似于腫瘤標志物的價值。研究發現，相較于術后未發生皮膚鱗狀細胞癌的腎移植術后患者，腎移植術后發生皮膚鱗狀細胞癌患者的Serpin B9 表達水平明顯升高，而且在復發性皮膚鱗狀細胞癌患者中發現Serpin B9高甲基化的循環T 細胞，提示Serpin B9 高表達是腎移植術后皮膚鱗狀細胞癌的高危因素[36]。此外，有研究發現不同胎齡胎盤組織滋養層細胞中的Serpin B9 表達水平存在明顯差異。與早孕胎盤相比，部分和完全葡萄胎滋養層細胞中的Serpin B9 表達水平明顯升高，其中以絨癌細胞系中的Serpin B9 表達水平最高。上述結果提示，滋養層細胞中Serpin B9 的表達水平與相應的免疫逃逸水平一致，并且妊娠滋養細胞中Serpin B9表達上調可能有助于腫瘤發生[37]。對生物信息學的挖掘結果也證實了這一點。口腔鱗狀細胞癌腫瘤易感基因篩查結果顯示，Serpin B9 在候選基因中排名第一位[38]。對兒童原發性惡性腦腫瘤的研究發現，29%在腫瘤發生期間檢測出Serpin B9的表達[39]。大量研究證實，Serpin B9 是腫瘤的高危因素，能夠促進腫瘤的發生，但目前鮮少研究關注具體的作用機制。

目前的研究認為，Serpin B9 能夠促進腫瘤的進展。正如前文所述，研究提示當腫瘤與宿主缺乏Serpin B9 時，腫瘤進展受到明顯抑制[6]。已有許多研究證實，Serpin B9 可以抑制顆粒酶B對腫瘤細胞的殺傷作用，因而促進腫瘤細胞的增殖。一項大型的肝癌隊列研究發現，78.1%的肝癌組織中表達Serpin B9，明顯高于癌旁正常組織的35.0%，并且肝癌組織中Serpin B9 的表達水平與腫瘤大小、分化程度和淋巴結轉移及分期密切相關；COX比例風險回歸模型分析顯示，Serpin B9 是肝癌患者不良預后的獨立預測指標，與總生存率呈負相關[40]。然而，也有研究得出了不同的結果，上調肝癌細胞中Serpin B9 的表達后，肝癌細胞凋亡率增加，而增殖能力降低；采用siRNA 下調Serpin B9 表達后，肝癌細胞凋亡能力明顯降低，而增殖能力增強；由此提示，Serpin B9 的表達似乎可以促進肝癌細胞凋亡[40]。另有部分研究在其他類型腫瘤中也發現了類似的結果。在鼻型NK/T 細胞非霍奇金淋巴瘤中研究發現，Serpin B9 表達缺乏與腫瘤細胞凋亡減少以及不良預后呈正相關，提示Serpin B9 低表達甚至不表達與腫瘤進展相關[41]。雖然大部分研究證實Serpin B9 對腫瘤具有促進作用，但也有研究得到了不同的結果，由此提示仍然需要對Serpin B9 在腫瘤中的作用及其機制開展更多的研究。

3.4 Serpin B9 與腫瘤轉移

Serpin B9 對于腫瘤轉移而言是一把雙刃劍，其不僅促進腫瘤轉移，同時也保護正常的組織細胞而阻止腫瘤轉移。NK 細胞能夠附著于肝竇毛細血管內皮上，肝臟中的NK 細胞和肝竇毛細血管內皮細胞高表達Serpin B9 可以保護肝臟微環境免受高活性穿孔素/顆粒酶B 的破壞，維護肝臟微環境的穩定，并殺死轉移性腫瘤細胞[42]。然而，另一項對結直腸腫瘤肝轉移的研究則發現，下調腫瘤細胞中Serpin B9 的表達水平可以抑制結直腸癌肝轉移，提示Serpin B9 表達可能促進腫瘤轉移[43]。上述2 項研究著眼的角度不同，得到的結果也互相矛盾，由此表明Serpin B9 在腫瘤轉移中的機制復雜。雖然部分研究得出了不同的結果，但是大多數研究均顯示Serpin B9 在腫瘤中高表達可以促進腫瘤轉移。一項對結直腸癌和研究結果顯示，顆粒酶B 的表達水平與對結直腸癌患者較好的預后有關，而Serpin B9 的表達與淋巴結轉移和不良預后有關[44]。有趣的是，在同種腫瘤細胞系中，Serpin B9 似乎還參與了不同部位的腫瘤轉移。研究發現，轉移至肺臟的乳腺癌細胞中Serpin B9 的表達水平較轉移至其他部位的乳腺癌細胞明顯升高[45]。總之，Serpin B9與腫瘤轉移相關性的研究正在不斷深入中。

3.5 Serpin B9 與腫瘤治療

化療耐藥、放療抵抗以及免疫逃逸是腫瘤治療失敗的主要原因。局部晚期直腸癌研究發現，Serpin B9 的表達水平與術前新輔助化療的應答效應呈負相關[46]。此外有研究發現，相較于沒有微小殘留灶的患者，遺留微小殘留灶的兒童急性淋巴細胞白血病患者的Serpin B9 表達水平明顯升高[47]。上述結果均提示，Serpin B9 高表達提示腫瘤耐藥，但也有少數研究發現了不同的結果。為了評估Serpin B9 的作用，有研究構建了3 株Serpin B9 野生型穩定轉染HeLa 細胞系和1 株表達無活性突變體Serpin B9 的細胞系，結果顯示野生型細胞株中Serpin B9 高表達能夠保護腫瘤細胞免于遭受NK 細胞介導的殺傷，但其表達對依托泊苷誘導的細胞凋亡沒有影響[48]。總之，Serpin B9 參與腫瘤耐藥，并在一定程度上提示存在高耐藥性。

研究發現，放射劑量與Serpin B9 表達呈劑量依賴性負相關[49]，表明放療可能使Serpin B9對腫瘤的保護作用降低。這項研究指出，放療會削弱Serpin B9 的作用，但尚不清楚Serpin B9 高表達是否與腫瘤的放療抵抗相關。除此之外，也有證據顯示，腫瘤經電離輻射后，Ⅰ型干擾素可以通過調節Serpin B9 而保護腫瘤細胞免于受到T 細胞介導的細胞毒作用[50]。這項研究的結論與前一項研究的結論不一致，因此目前對于放療與Serpin B9 之間的關系，仍需進一步探索。

在免疫治療方面，目前已有研究證實Serpin可以引發腫瘤的免疫逃逸，導致免疫治療失效，尤其是基于顆粒酶B 的療法。食管癌和胃癌的相關研究發現，Serpin B9 表達下調可使NK 細胞被殺傷，最終導致NK 細胞免疫治療失敗[51]。

4 Serpin B9 與腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）

干細胞是指具有無限增殖、自我更新及多向分化能力的未分化細胞。研究發現，骨髓來源的間充質干細胞和胚胎干細胞均能高表達Serpin B9，從而保護其不被細胞毒性T 細胞釋放的顆粒酶B所殺傷[52-53]，這一結果與之前的研究結果一致，即Serpin B9 能夠保護正常干細胞而避免其發生凋亡。然而，目前有關Serpin B9 能否維持正常干細胞干性的研究卻很少，因此Serpin B9 與CSCs 的相關研究或許能夠提供一些啟示。CSCs是腫瘤中具有極強的自我更新、多向分化和無限增殖能力的細胞，與腫瘤的發生、發展、轉移和耐藥均密切相關[54-55]。研究發現，具有高水平干性標記（Nanog、Oct3/4 和Sox2）和自我更新能力的乳腺癌干細胞表達較高水平的C-X-C基序趨化因子受體4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）和磷酸化p38。CXCR4 是趨化因子基質細胞衍生因子1[又被稱為C-X-C基序趨化因子配體12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）] 的特異性受體，目前證實其能夠維持CSCs 的干性，并參與CSCs 的趨化[56]。激活CXCR4/ 磷酸化p38 軸能夠促進Serpin B9 高表達，干擾機體的免疫監視系統，保持乳腺癌干細胞的增殖和自我更新能力[57]。除干擾免疫系統以外，Serpin B9 還能夠通過其他機制維持CSCs 的干性。HJELMELAND 等[58]研究發現，在酸性腫瘤微環境中，腦膠質細胞瘤中的缺氧誘導因子2α（hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α）的表達水平明顯上調，而Serpin B9作為HIF-2α 特異性靶基因，其在腦膠質干細胞中除了能夠直接結合靶基因啟動子以外，還可

5 總結與展望

Serpin B9 作為絲氨酸蛋白酶抑制劑，具有調節機體炎癥、補體、凝血和免疫等多種病理生理過程的作用，參與多種疾病的發生和發展，還能夠抑制顆粒酶B 的殺傷作用，從而保護腫瘤細胞。目前的研究已證實，Serpin B9 能夠減少腫瘤細胞凋亡，增強腫瘤的免疫逃逸，促進腫瘤的發生和轉移以及腫瘤細胞的增殖，導致治療失敗。此外，臨床研究發現Serpin B9 能夠作為化療和免疫治療效果以及預后的預測指標。Serpin B9 可能成為腫瘤治療的一個潛在的新靶點，但仍需進一步探索具體的機制。

越來越多的證據表明，CSCs 是腫瘤發生、發展、轉移和耐藥的主要負責細胞群。CSCs 的自我更新和無限增殖能力有助于腫瘤生長和維持。近年來的研究指出，Serpin B9 能夠通過免疫逃逸保護CSCs 免于發生凋亡，并且參與維持CSCs 的干性，這是一項令人驚喜的發現。未來仍需要開展更多層面的研究，以深入闡明Serpin B9 在腫瘤和CSCs 中的作用及其可能的臨床應用價值。