硫酸右旋糖苷通過抑制M2型巨噬細胞極化以減弱M2型巨噬細胞對HGC-27胃癌細胞侵襲和遷移的促進作用

郭嘉欣 ，李夢琪，趙 媛，陶月佳，李 冰，徐遠義，黃允寧

胃癌是世界范圍最常見的消化系統惡性腫瘤[1]。由于胃癌早期隱匿性強，患者就診時往往已發展為晚期轉移性胃癌，其死亡率高[2]。盡管已出現許多治療胃癌的新興療法，如根除幽門螺旋桿菌、術前或術后輔助化療、免疫療法、靶向治療以及一些小分子抑制劑治療等[3]，但是胃癌的進展、復發和轉移導致其5 年總生存率仍低于35%[4]。

胃癌腹腔轉移不僅是腫瘤進展的結果，更可能是腫瘤微環境內廣泛的細胞間相互作用的結果[5]。有研究指出，腫瘤微環境中的M2 型巨噬細胞通過促進胃癌細胞的侵襲和遷移而促進胃癌進展[6]。近年來的研究指出，通過直接或間接抑制M2 型巨噬細胞的增殖或募集是抗腫瘤免疫療法的潛在目標，并且一些靶向M2 型巨噬細胞的試劑正在進行臨床前試驗[7]。因此，研究靶向胃癌中的M2 型巨噬細胞，可能為胃癌腹腔轉移的治療提供一些新的思路。

硫酸右旋糖苷（dextran sulfate，DS）是一種相對分子質量為5×105的糖類，能夠直接抑制胃癌細胞的侵襲和遷移以及裸鼠胃癌腹腔移植瘤的轉移[8-9]。本課題組的前期研究發現，腹腔內注射DS 的裸鼠的轉移瘤組織中M2 型巨噬細胞的浸潤程度明顯下降[10]，表明DS 可能通過影響腫瘤免疫微環境而影響胃癌的發生和發展。

本研究首先通過體外實驗檢測DS 對M2 型巨噬細胞極化和募集的影響，以及DS 對M2 型巨噬細胞與胃癌細胞之間相互作用的影響，然后應用免疫組織化學法分析M2 型巨噬細胞與胃癌臨床病理特征之間的關系，以期為DS 的抗腫瘤研究提供更多實驗依據。

1 材料與方法

1.1 胃癌組織標本收集

收集寧夏回族自治區人民醫院2018 年10 月—2019 年12 月經手術切除、術后病理確診為胃癌的病理組織標本34 例，以及對應的癌旁正常組織（選取距腫瘤邊緣＞2 cm 的胃黏膜組織）標本12例。34 例患者中，男性20 例、女性14 例，年齡范圍為44～81 歲。所有患者術前均未接受過放療或化療，并且不伴有其他惡性腫瘤。所有的組織標本均經常規固定和脫水處理后，石蠟包埋制作成蠟塊；隨后經切片機切成4 μm 厚度的連續切片以供后續研究。本研究獲得寧夏醫科大學醫學倫理審查委員會批準（批準號：2020103）。

1.2 細胞、試劑及儀器

人胃癌細胞HGC-27 和人單核細胞THP-1購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。DS（貨 號：D8906）和佛波 酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）購自美國Sigma公司，白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）和IL-13 購自美國PeproTech 公司。兔抗人CD163和CD206 單克隆抗體購自英國Abcam 公司，兔抗人CD68 單克隆抗體購自美國CST 公司，兔抗人N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，兔抗人基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）多克隆抗體和鼠抗人GAPDH 單克隆抗體購自武漢賽維爾生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒和BCA 檢測試劑盒等購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，孔徑為8.0 μm 的Transwell 小室購自廣州潔特生物過濾股份有限公司，鋪設有孔徑為0.4 μm 預制膠的Transwell 小室購自美國Corning 公司。

熒光顯微鏡和倒置光學顯微鏡均為日本Olympus 公司產品，凝膠圖像分析儀（Amersham Imager 600，GEL）為美國GE Healthcare 公司產品。

1.3 細胞培養及DS 的配制

HGC-27 胃癌細胞培養于含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640 培養液中，THP-1細胞培養于含1%青鏈霉素和15%胎牛血清的RPMI 1640 培養液中，細胞均置于37 ℃、CO2體積分數為5%、恒溫恒濕的培養箱內進行培養。稱取0.3 g DS 溶于10 mL PBS 中，配制獲得濃度為3%的DS 母液，細胞培養時向培養液中加入相應體積的DS 母液，使DS 的終濃度為0.3%。

1.4 M0 和M2 型巨噬細胞的誘導及驗證

1.4.1 M0 和M2 型巨噬細胞的誘導流程

取對數生長期的THP-1 細胞，離心收集細胞，用培養液重懸后，調整細胞密度為1×106個/mL，取3 mL THP-1 細胞懸液接種至直徑為6 cm 的培養皿中，加入終濃度為200 ng/mL 的PMA 進行干預，誘導24 h 后厚獲得M0 型巨噬細胞。將誘導獲得的M0 型巨噬細胞除去培養液后，用PBS 清洗細胞2 次；加入質量濃度為100 ng/mL 的PMA以及20 ng/mL 的IL-4 和IL-13 誘導24 h 后獲得M2 型巨噬細胞。

1.4.2 免疫細胞熒光法驗證M0 和M2 型巨噬細胞的誘導結果

分別用免疫細胞熒光檢測誘導的巨噬細胞上M0 型巨噬細胞表面標志物（CD68）和M2 型巨噬細胞表面標志物（CD206）的表達水平。將制備獲得的M0 和M2 型巨噬細胞以1×105個細胞/片的密度爬片后，用100% 甲醇溶液固定細胞5 min，加入0.1% Tween-20 通透處理30 min，用含10%山羊血清的封閉液封閉處理30 min，加入一抗[兔抗人CD206 和CD68 單克隆抗體（體積稀釋比例均為1 ∶1 000）] 4 ℃孵育過夜，再加入二抗[FITC-山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1 ∶20）] 37 ℃孵育1 h，避光條件下用PBS浸泡5 min，清洗3 次，加入DAPI 進行細胞核染色，最后用抗淬滅處理后封片，熒光顯微鏡下觀察熒光染色情況并拍照。

1.4.3 蛋白質印跡法檢測THP-1 細胞、M0 型巨噬細胞和M2 型巨噬細胞中CD163 蛋白的表達水平

參照全蛋白提取試劑盒操作說明書，提取誘導獲得的M0 型巨噬細胞、M2 型巨噬細胞及THP-1 細胞中蛋白，采用BCA 法進行蛋白定量。按40 μg/10 μL 的蛋白量進行上樣，行10%SDS-PAGE 分離蛋白，并將分離后的蛋白轉移至PVDF 膜上；用含5%脫脂牛奶的封閉液常溫封閉1 h，加入一抗[兔抗人CD163 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶1 000）] 4 ℃孵育過夜；洗膜后加入二抗[辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1 ∶5 000）]常溫下孵育1 h，滴加電化學發光顯影液，采用凝膠圖像分析儀進行分析。應用Image J 軟件對蛋白條帶進行分析，以目的蛋白的灰度值與內參照蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.5 DS 對M0 和M2 型巨噬細胞誘導極化及趨化募集能力的影響

1.5.1 細胞分組

實驗共分成4 組：M0 組、M0DS 組、M2組和M2DS 組。M0 組：M0 型巨噬細胞（通過誘導獲得，見1.4.1 節）。M2 組：M2 型巨噬細胞（通過誘導獲得，見1.4.1 節）。M0DS 組：在M0 型巨噬細胞誘導過程中，懸浮的THP-1 細胞經PMA 處理8～12 h 后開始貼壁生長，于12 h時加入DS（終濃度為0.3%）繼續誘導12 h。M2DS 組：在M2 型巨噬細胞極化過程的起始階段，用DS（終濃度為0.3%）和100 ng/mL 的PMA 合 并20 ng/mL 的IL-4 和IL-13 處 理M0型巨噬細胞24 h。

1.5.2 蛋白質印跡法檢測各組巨噬細胞中CD163及CD206 的蛋白表達水平

收集4 組巨噬細胞（細胞分組及處理見1.5.1節），采用蛋白質印跡法檢測巨噬細胞中CD163和CD206 蛋白的表達水平，蛋白檢測流程同1.4.3節。其中，一抗為兔抗人CD163 和CD206 單克隆抗體（工作液體積稀釋比例均為1 ∶1 000）。

1.5.3 Transwell 小室遷移實驗檢測巨噬細胞的趨化募集能力

實驗同樣分為4 組：M0 組、M0DS 組、M2組和M2DS 組。在置有Transwell 小室的24 孔板的下室中接種HGC-27 胃癌細胞（3×105個/600 μL），在上室中分別接種各組巨噬細胞（M0組、M0DS 組、M2 組和M2DS 組）1×105個/500 μL。待上下小室內細胞貼壁后共培養24 h，取出小室，用PBS 清洗后晾干，用4%多聚甲醛溶液固定細胞20 min，用棉簽輕柔擦去小室內未穿過小室膜的殘留細胞。用0.1%結晶紫染色15 min，流水下沖洗干凈后，在光學顯微鏡下觀察細胞形態并計數。隨機選取5～10 個視野進行拍照計數，以此反映各組巨噬細胞的趨化能力。

1.6 DS 對巨噬細胞（M0 和M2 型）促 進HGC-27 胃癌細胞侵襲和遷移以及侵襲和遷移相關蛋白表達的影響

1.6.1 劃痕愈合實驗檢測各組巨噬細胞（M0、M0DS、M2 和M2DS）對HGC-27 胃癌細胞遷移能力的影響

實驗共設置5 組：對照組僅有HGC-27 胃癌細胞，M0 組、M0DS 組、M2 組和M2DS 組均為HGC-27 胃癌細胞與巨噬細胞（誘導獲得，見1.5.1 節）共培養組。收集對數生長期的HGC-27 胃癌細胞，以2×106個/孔的密度接種于6 孔板下室，并提前將4 組巨噬細胞以1×106個/孔的密度接種于Transwell 小室上室中。待下室中HGC-27 胃癌細胞貼壁后取出6 孔板，用200 μL槍頭水平劃3 條直線，PBS 漂洗后，在光學顯微鏡下拍照。將上室放入6 孔板中，共培養系統中加入無血清培養液。共培養24 h 后，取出6 孔板，棄去上層小室，觀察胃癌細胞劃痕處細胞匯合情況，并拍照。細胞遷移率（%）＝（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積。

1.6.2 Transwell 小室侵襲實驗檢測各組巨噬細胞（M0、M0DS、M2 和M2DS）對HGC-27 胃 癌細胞侵襲能力的影響

實驗設置同1.6.1 節，共設置5 組。將HGC-27 胃癌細胞以1×105個/孔的密度接種于24 孔Transwell 小室（鋪設有預制膠）中，再將4 組巨噬細胞以3×105個/孔的密度接種于24 孔板底部。將上室置于24 孔板中，共培養24 h 后，觀察發生侵襲的細胞數，檢測流程同1.5.3 節。

1.6.3 蛋白質印跡法檢測共培養后HGC-27 胃癌細胞中侵襲和遷移相關蛋白的表達水平

提取HGC-27 胃癌細胞中的蛋白，蛋白檢測流程同1.4.3 節。采用的一抗為兔抗人N-cadherin（體積稀 釋比例 為1 ∶500）、Vimentin（體積稀釋比例為1 ∶1 000）和MMP-2（體積稀釋比例為1 ∶500）多克隆抗體以及鼠抗人GAPDH 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶1 000）。

1.7 免疫組織化學法檢測胃癌及癌旁正常組織中M2 型巨噬細胞的浸潤情況

胃癌及癌旁正常組織切片經二甲苯溶液脫蠟后，梯度乙醇溶液復水，枸櫞酸鈉修復組織抗原，加入3% H2O237℃孵育20 min 后，用含10%山羊血清的封閉液37 ℃封閉30 min；加入一抗兔抗人CD163 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶400）4 ℃孵育過夜，隨后加入二抗[山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司產品）]，二步法孵育。DAB 染色，蘇木精復染細胞核，封片后，在光學顯微鏡下觀察細胞染色情況。CD163 陽性細胞數判定標準參閱參考文獻[11]提供的實驗方法：在光學顯微鏡下（放大倍數為200 倍）觀察染色結果，每張切片隨機選擇5 個不重疊的區域，收集圖像并計數陽性細胞數，取其平均值作為該張切片的陽性細胞數。根據統計結果，以34 例胃癌組織染色結果的中位數，將34 例胃癌患者分為CD163 高表達組（＞322 個/200 倍視野下）和低表達組（322 個/200 倍視野下）。

1.8 統計學方法

應用SPSS 22.0 軟件對實驗數據進行統計學分析。所有實驗均獨立重復3 次，數據以表示。臨床病理特征分析采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。2 組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用Turkey-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外誘導M2 型巨噬細胞

光學顯微鏡下觀察發現（圖1A），單核細胞THP-1 呈懸浮生長，外形為圓形且規則，細胞膜透亮且折光性良好。經PMA 誘導24 h 后，THP-1 細胞開始貼壁生長，細胞體積增大，細胞形態呈橢圓形或有突起，提示已分化為M0 巨噬細胞（M0 組）。M0DS 組（PMA 誘導12 h 時再加入終濃度為0.3%的DS 繼續誘導12 h）細胞雖然仍貼壁生長，但是部分細胞膜仍透亮，提示細胞貼壁不完全，并且與M0 組細胞相比細胞體積較小。用IL-4 和IL-13 繼續誘導培養M0 巨噬細胞24 h 后，細胞變為細長梭形且形態多樣，提示M0 巨噬細胞極化為M2 型巨噬細胞（M2 組）。采用IL-4 和IL-13 繼續干預M0 巨噬細胞的同時，加入終濃度為0.3%的DS，即為M2DS 組，M2DS 組中的巨噬細胞僅貼壁，細胞突起較少，無M2 型巨噬細胞的形態特征，與M0 巨噬細胞相似。

應用免疫細胞熒光法檢測誘導是否成功。結果（圖1B）顯示，M0 巨噬細胞標志物CD68 在細胞膜和細胞質中均有表達，M2 型巨噬細胞標志物CD206 表達于細胞膜上，并且大部分細胞均有表達。

蛋白質印跡法檢測結果（圖1C）顯示，THP-1 單核細胞基本不表達CD163，M0 巨噬細胞中的CD163 表達量低于M2 型巨噬細胞，上述結果表明M2 型巨噬細胞誘導成功。

Fig.1 The morphology of M0-type and M2-type macrophages and dextran sulfate (DS)-treated M0-type and M2-type macrophages was observed under an inverted microscope (A,×400),and the expressions of macrophage surface markers (CD68 and CD206) were detected by immunocytofluorescence (B: fluorescent staining,×400) and Western blotting (C),respectively.THP-1 group: THP-1 cells were not treated with any drugs;M0 group: THP-1 cells were treated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA);M0DS group: THP-1 cells were treated with PMA and DS;M2 group: M0-type macrophages were treated with PMA combined with interleukin-4 (IL-4) and IL-13;M2DS group: M0-type macrophages were treated with PMA combined with IL-4,IL-13 and DS.The expressions of M0-type macrophages surface marker CD68 and M2-type macrophage surface marker CD206 were detected by immunocytofluorescence.Western blotting was used to detect the expression levels of CD163 in THP-1 cells,M0-type macrophages and M2-type macrophages.圖1 倒置光學顯微鏡下觀察M0 和M2 型巨噬細胞以及DS 處理后M0 和M2 型巨噬細胞的形態（A：×400），分別采用免疫細胞熒光法（B：熒光染色×400）和蛋白質印跡法（C）檢測巨噬細胞表面標志物的表達情況

2.2 DS 可抑制M2 型巨噬細胞極化

為檢測DS 對M2 型巨噬細胞極化的影響，采用蛋白質印跡法檢測M2 型巨噬細胞標志物CD163 和CD206 蛋白的表達水平。結果（圖2）顯 示，M0 組 和M0DS 組細胞 中CD163 和CD206 蛋白表達水平的差異均無統計學意義；M2 組細胞中CD163 和CD206 蛋白的表達水平均高 于M0DS 組（P＜0.001 和P＜0.01）；M2DS 組中CD163 和CD206 蛋白的表達水平均較M2 組明顯下調（P＜0.001 和P＜0.05）。

2.3 DS 抑制M2 型巨噬細胞的趨化募集能力

采用Transwell 小室遷移實驗檢測巨噬細胞響應胃癌細胞的趨化募集能力。結果（圖3）顯示，M2 組中穿過小室膜的細胞數為（646.1±116.5）個，較M0 組的（299±103.8）個、M0DS 組的（113.6±31.94）個和M2DS 組的（34.1±15.42）個均明顯增多（P均＜0.001），M0DS 組中發生遷移的巨噬細胞數較M0 組明顯減少（P＜0.001），M2DS 組中發生遷移的巨噬細胞數較M2 組明顯減少（P＜0.001）。

Fig.3 Trans well assay was used to detect the chemotaxis and recruitment abilities of macrophages cocultured with HGC-27 cells (crystal violet staining,×200).M0 group: THP-1 cells were treated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA);M0DS group: THP-1 cells were treated with PMA and DS;M2 group: M0-type macrophages were treated with PMA combined with interleukin-4 (IL-4) and IL-13;M2DS group:M0-type macrophages were treated with PMA combined with IL-4,IL-13 and DS.***P＜0.001,vs M2 group;△△△P＜0.001,vs M0 group (n=3).圖3 Transwell 小室實驗檢測巨噬細胞響應HGC-27 胃癌細胞的趨化募集能力

2.4 DS 干預巨噬細胞極化后對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響

采用劃痕實驗檢測各組巨噬細胞對HGC-27胃癌細胞橫向遷移能力的影響。結果（圖4A）顯示，對照組（僅有HGC-27 胃癌細胞）細胞培養24 h 時后的劃痕愈合率為（23.33±4.04）%，而與M0 型巨噬細胞（M0 組）和M2 型巨噬細胞（M2組）共培養后的HGC-27 胃癌細胞的劃痕愈合率分別為（54.33±5.89）% 和（79.00±7.55）%，M0 組和M2 組HGC-27 胃癌細胞的遷移能力均較對照組明顯提高（P＜0.01 和P＜0.001），表明M0 和M2 型巨噬細胞均可促進HGC-27 胃癌細胞的遷移能力；與M0DS 或M2DS 組巨噬細胞共培養后，HGC-27 胃癌細胞的劃痕愈合率分別為（48.00±3.00）% 和（56.00±5.29）%，M0DS 組和M2DS 組HGC-27 胃癌細胞的遷移能力均有明顯下降（P＜0.05 和P＜0.001），表明DS 能夠明顯抑制M0 和M2 型巨噬細胞對HGC-27 胃癌細胞遷移能力的促進作用。

采用Transwell 小室侵襲檢測各組巨噬細胞對HGC-27 胃癌細胞侵襲能力的影響。結果（圖4B）顯示，對照組中穿過小室膜的細胞數為（93.8±12.81）個，HGC-27 胃癌細胞與M0 巨噬細胞共培養后穿過小室膜的細胞數為（92.20±10.43）個，與M2 型巨噬細胞共培養后穿過小室膜的細胞數為（157.80±20.07）個，與M0DS 組共培養后穿過小室膜的細胞數為（29.20±9.01）個，與M2DS 組巨噬細胞共培養后穿過小室膜的細胞數為（60.00±10.65）個；與對照組相比，HGC-27 胃癌細胞與M2 型巨噬細胞共培養后，其侵襲能力明顯提高（P＜0.001），而與M0DS 組和M2DS 組細胞共培養后，其侵襲能力明顯受抑（P均＜0.001）。上述結果表明，DS 可以抑制M0 和M2 型巨噬細胞對胃癌細胞的趨化吸引作用。

Fig.4 The invasion (A) and migration (B) abilities of HGC-27cells after co-culture with M0-type and M2-type macrophages and DS-treated M0-type and M2-type macrophages were detected by woundhealing assay (×40) and Transwell assay (crystal violet staining,×400),respectively.Control group: HGC-27 cells;M0 group: THP-1 cells treated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA);M0DS group: THP-1 cells treated with PMA and DS;M2 group: M0-type macrophages treated with PMA combined with interleukin-4 (IL-4) and IL-13;M2DS group: M0-type macrophages treated with PMA combined with IL-4,IL-13 and DS.**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group;△P＜0.05,△△△P＜0.001,vs M0 group;▲▲▲P＜0.001,vs M2 group (n=3).圖4 劃痕愈合實驗（A）和Transwell 小室侵襲實驗（B）檢測巨噬細胞對HGC-27 胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響

2.5 DS 干預巨噬細胞極化后對胃癌細胞侵襲和遷移相關蛋白表達的影響

采用蛋白質印跡法檢測共培養后的HGC-27 胃癌細胞中侵襲和遷移相關蛋白N-cadherin、MMP-2 和Vimentin 的表達情況。結果（圖5）顯示，與M2 型巨噬細胞共培養后，HGC-27 胃癌細胞中N-cadherin、MMP-2 和Vimentin 蛋白的表達水平均明顯上調（P＜0.001 和P＜0.01）；而與M2DS 組巨噬細胞共培養后，HGC-27 胃癌細胞 中N-cadherin、MMP-2 和Vimentin 的表達水平均較M2 組明顯下調（P＜0.001 和P＜0.01）。

Fig.6 The infiltration degree of M2-type macrophages in 34 cases of gastric cancer tissues (GT) and the paracancerous tissues (PT) were detected by immunohistochemistry (DAB staining).**P＜0.01.圖6 免疫組織化學法檢測34 例胃癌組織及癌旁正常組織中M2 型巨噬細胞的浸潤情況

表1 胃癌組織中CD163 蛋白的表達與臨床病理特征之間的關系Table 1 The relationship between CD163 expression and the clinicopathological characteristics in gastric cancer tissues[n (%)]

2.6 M2 型巨噬細胞在胃癌及正常胃黏膜組織中的浸潤情況

免疫組織化學法檢測結果（圖6）顯示，M2 型巨噬細胞為形態不規則有突起的棕黃色細胞，定位于腫瘤間質中；CD163 主要表達于M2 型巨噬細胞的細胞膜上，少量表達于細胞質中。胃癌組織間質中M2 型巨噬細胞的浸潤程度[（365±198）個]明顯高于癌旁正常組織[（167±93）個]（P＜0.01）。

2.7 胃癌組織中CD163 蛋白的表達與臨床病理特征之間的關系

胃癌組織中CD163 蛋白的表達與患者的性別、年齡、腫瘤浸潤深度以及是否有淋巴結轉移之間無明顯相關性（P均＞0.05），但與胃癌的分化程度和臨床分期有關（P均＜0.05）。

3 討論

世界范圍內胃癌的發病率和致死率均很高[1]。胃癌的發生和發展不僅取決于癌細胞自身，也與腫瘤微環境的生理狀態密切相關。越來越多的研究表明，胃癌微環境中的免疫細胞尤其是數量最多的M2 型巨噬細胞與胃癌細胞之間存在相互調節作用，可以促進胃癌的發生和發展[12-14]。有研究提示，腫瘤細胞通過分泌細胞因子或趨化因子以招募外周血和組織中駐留的單核細胞或巨噬細胞，誘導其極化為M2 型巨噬細胞；M2 型巨噬細胞可以通過抑制炎性反應、促進腫瘤細胞生長和轉移以及調節免疫系統等，發揮促進腫瘤發生和發展的作用[15-16]。因此，本研究以M2 型巨噬細胞作為切入點，為探索M2 型巨噬細胞在抗腫瘤中的作用提供理論依據。

CD206和CD163是M2型巨噬細胞的2種表面標志物。TARIQ 等[17]的研究顯示，用吉非替尼處理已經IL-13 處理的M2 型巨噬細胞72 h后，M2 型巨噬細胞中CD206 和CD163 蛋白的表達水平顯著下調，表明吉非替尼可有效抑制IL-13 誘導的M2 型巨噬細胞的極化，因此M2型巨噬細胞中CD206 和CD163 蛋白的表達下調表明M2 型巨噬細胞的極化受到抑制。本課題組的前期研究證實，0.3% DS 是可以對胃癌細胞發揮作用的最低濃度，并且對M0 型和M2 型巨噬細胞的活性均無影響，對肝腎功能也無顯著毒性。本研究發現，在單核細胞誘導成M0 巨噬細胞過程中加入DS 后，細胞不易貼壁且細胞體積變?。辉贛2 型巨噬細胞極化過程中加入DS 后，M2型巨噬細胞的形態不再呈現細長或梭形的多樣化特征；蛋白質印跡法檢測結果顯示，經DS 處理后，M2 型巨噬細胞（M2DS）中CD163 和CD206蛋白的表達水平顯著下降，表明DS 在M2 型巨噬細胞的極化過程中不僅影響其體積和細胞形態，還抑制M2 型巨噬細胞的極化。然而，DS抑制M2 型巨噬細胞極化所涉及的具體分子機制，仍有待進一步研究。

胃癌細胞有招募單核細胞或巨噬細胞進入胃癌微環境的能力。巨噬細胞進入腫瘤微環境后可極化為M2 型巨噬細胞，進而發揮促癌作用[18]，而抑制胃癌細胞對M2 型巨噬細胞的招募有助于抑制腫瘤的惡性進展。為檢測胃癌細胞對DS 干預后巨噬細胞募集趨化能力的影響，本研究進一步構建體外巨噬細胞與胃癌細胞共培養模型，發現M2 型巨噬細胞響應胃癌細胞的趨化募集能力強于M0 巨噬細胞，而DS 干預后的M2 型巨噬細胞的趨化募集能力明顯減弱。這部分結果表明，DS 可能通過干預M2 型巨噬細胞的極化過程，阻止M0 巨噬細胞向M2 型巨噬細胞極化，從而降低M2 型巨噬細胞中CD206 和CD163 蛋白的表達水平，繼而降低M2 型巨噬細胞的趨化募集能力，即抑制其向胃癌細胞移動。目前針對M2型巨噬細胞的靶向治療措施包括巨噬細胞極化重編程、耗竭性治療、阻斷募集以及靶向M2 型巨噬細胞釋放的生成因子等[7,14]。本研究結果表明，DS 對M2 型巨噬細胞的影響是多方面的，既能抑制其極化過程，又能削弱其募集能力。

研究結果表明，M2 型巨噬細胞有促進胃癌細胞侵襲和遷移的潛力[18]。本研究中的劃痕及侵襲實驗均表明，M0 型和M2 型巨噬細胞均可增強胃癌細胞的橫向遷移能力，M2 型巨噬細胞能夠增強胃癌細胞的侵襲能力；而DS 干預M2 型巨噬細胞極化過程后，這種促進能力均被弱化。N-cadherin、MMP-2 和Vimentin 在腫瘤細胞的侵襲和遷移中發揮重要作用，通過降解細胞外基質，引發腫瘤細胞的上皮-間質轉化，從而促進腫瘤細胞的侵襲性，這在腫瘤轉移的過程中尤為重要[19-20]。本研究中的蛋白質印跡法檢測結果表明，M2 型巨噬細胞能夠顯著提高胃癌細胞中N-cadherin、MMP-2 和Vimentin 的表達水平，而M2DS 組的M2 型巨噬細胞對胃癌細胞中這些蛋白的表達無影響。上述結果顯示，M2 型巨噬細胞能夠促進胃癌細胞的侵襲和遷移能力，并且增加胃癌細胞中侵襲和遷移相關蛋白的表達水平，而DS 能夠抑制M2 型巨噬細胞對胃癌細胞侵襲和遷移的促進作用以及侵襲和遷移相關蛋白的上調作用，表明DS 可以通過調控M2 型巨噬細胞間接抑制胃癌細胞的侵襲和遷移。

本研究首先通過細胞實驗揭示DS 對M2 型巨噬細胞的極化及其與胃癌細胞相互作用的影響，隨后對人胃癌組織中M2 型巨噬細胞的表達及其意義進行研究。免疫組織化學法檢測結果顯示，胃癌組織中M2 型巨噬細胞的數量較癌旁正常組織中明顯增多；將34 例胃癌組織分為高表達組和低表達組，結果顯示M2 型巨噬細胞的浸潤程度與胃癌的分化程度和臨床分期呈正相關，這與既往張偉杰[21]和ZHU 等[22]報道的結果基本一致。本研究結果表明，胃癌組織分化程度越低、臨床分期越晚，M2 型巨噬細胞在胃癌組織中的浸潤程度就越高。上述結果提示，M2 型巨噬細胞在胃癌的發生和發展中扮演重要角色，因此有望將其作為胃癌治療的靶點而發揮抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究表明DS 能夠干擾M0 巨噬細胞向M2 型巨噬細胞的極化，并削弱其趨化募集能力；DS 可以抑制M2 型巨噬細胞對胃癌細胞侵襲和遷移的促進能力以及侵襲和遷移相關蛋白的表達；胃癌組織中的M2 型巨噬細胞數量顯著增多，并且與胃癌組織的分化程度和臨床分期呈正相關。關于DS 干預M2 型巨噬細胞極化的具體機制尚待進一步研究，以期為DS 抗腫瘤研究提供更多的實驗室證據。