大鼠深低溫停循環模型研究進展

唐 卓， 劉 宇

1.中國醫科大學 研究生院，遼寧 沈陽 110122；2.北部戰區總醫院 心血管外科，遼寧 沈陽 110016

自1951年，Gibbon發明體外循環(cardiopulmonary bypass，CPB)技術以來，CPB一直作為心臟外科的基石[1]。兒童復雜先天性心臟病和成人主動脈弓病變的修復往往需要CPB和深低溫停循環(deep hypothermia circulatory arrest，DHCA)的支持[2]。盡管DHCA為手術提供了無血視野，有效地提高了患者的存活率，但其對氧化應激、止血和炎癥通路有顯著的刺激作用，這些均與圍術期腦損傷的發病機制有關[3]。有研究發現，DHCA后譫妄和認知功能障礙的發生率約為25%[4]。目前，DHCA損傷的潛在機制尚未明確闡明[5]。為了探索DHCA后器質性功能障礙的確切機制，需要建立安全、簡單的動物模型，以改善預后。現就大鼠DHCA模型研究現狀作一綜述。

1 大鼠DHCA模型的優勢

由于大型動物的解剖結構和大小與人類相似，最初用于CPB/DHCA研究的動物模型為犬、豬和羊等[6]。然而，大型動物CPB/DHCA模型存在成本高、缺乏神經認知功能評估方法、長期恢復困難等缺點[7-8]。近年來，大鼠作為一種小型嚙齒動物，備受眾多學者的關注，其原因如下：(1)價格低廉；(2)與人類心血管系統解剖結構相似；(3)在基因和蛋白質水平上有豐富的檢測手段；(4)實驗過程簡便，可獨立完成[6，9]。因此，CPB/DHCA的大鼠模型可允許更大樣本量的研究及長期神經學結果的評估。

2 大鼠DHCA模型的建立與發展

1967年，Popovic等[10]首次對大鼠CPB模型進行了描述。隨后，大鼠CPB模型不斷被開發改進[11-13]。然而，其大多采用完全的胸骨切開術，忽略了CPB后大鼠長期生存的問題；同時，使用具有較大預充體積的鼓泡或膜式氧合器，利用供體大鼠的血液啟動CPB，因此，體外氧合引起的炎癥反應的研究受到輸注供體血液的影響[14]。

近年來，較完善的大鼠DHCA模型已被提出。2011年，Waterbury等[15]對大鼠CPB管路進行了改進，其采用外周插管技術，將20 G套管針置入左股動脈作為動脈灌注，22 G套管針置入右股動脈作為血壓監測，右頸總靜脈采用改良的4孔16 G口徑血管導管置入右心房進行靜脈引流；同時，在CPB管路中，使用真空輔助靜脈引流、熱轉換器及微型新型氧合器；當CPB開始后，調節氧合器氣體流量并維持在1.0～2.5 L/min；將大鼠冷卻至14℃～18℃，循環停止后，DHCA持續15 min，再將大鼠重新加熱至34℃～35℃。通過這些改進，大鼠灌注流量可達到100～150 ml/(kg·min)，與臨床人體CPB流量相符。這一模型的建立為CPB和DHCA的進一步研究提供了一個簡單的研究系統。2018年，Jiang等[16]對大鼠DHCA模型做出了進一步的改進，其采用臨床輸液器改裝的封閉回路，替代既往用重力輔助靜脈引流的方式。術中運用負壓監測器維持負壓<-60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，從而避免血細胞損傷。整個CPB回路由8 ml 6%的膠體、0.5 mEq的碳酸氫鈉及100 U的肝素啟動。當CPB開始時，流速可維持150～180 ml/(kg·min)，在降溫期間流速減少一半。當顱內溫度達到18℃時，開始DHCA，持續45 min后，重新啟動CPB，加熱大鼠至心包溫度34℃，同時逐漸增加流速至150～180 ml/(kg·min)。該方法成功縮小了CPB回路的接觸面積，減少預充液容積，從而實現了高效并平價的增強靜脈引流模型。

近年來，關于大鼠DHCA模型的研究報道不斷增加，但插管位置、設備的選擇以及溫度的控制仍然是爭論的焦點。此外，多數研究僅觀察到了DHCA后14 d的神經功能和組織學結果，對于長期存活大鼠模型的恢復時間尚不確定[17]。Liu等[9]成功建立了DHCA的長期存活大鼠模型，并確定了神經系統的恢復時間框架，將24 G血管導管置入左股動脈淺支，以監測血壓并分析動脈血氣，用20 G導管置入尾動脈，做CPB循環的動脈氧合血灌注，并通過自制的多孔導管置入右頸內靜脈，調整到右心房和下腔靜脈的位置，以達到滿意的靜脈引流。整個CPB回路由儲血罐、小型氧合器、雙滾動泵以及熱轉換器組成，同時使用加熱器/冷卻器和熱毯，以達到精確的溫度控制。CPB持續時間為105 min，在常溫CPB階段的5 min內，流速設定為120 ml/(kg·min)，在降溫期間，流量下降一半。每只大鼠在30 min內冷卻到直腸溫度18℃后，DHCA維持30 min，再將大鼠重新加熱至35℃以上，直至CPB停止。通過該模型，成功地在30 min DHCA持續時間后觀察到組織病理學缺陷，并確定30 d的恢復時間框架。該模型的成功建立可以進一步探索DHCA術后不良腦結局的機制，并在特定的時間窗內測試新的治療方法。

3 大鼠DHCA模型的實驗指標

3.1 神經及運動功能評估 大鼠的神經功能可以使用已建立的神經評分系統進行標準化的測試。2017年，Chio等[18]采用改良的神經損傷評分對大鼠進行急性神經損傷評估，得分越高，損傷越嚴重，最高為14分；同時，采用斜面系統和微控制器檢測肢體運動功能，傾斜面角度越低，肢體運動功能越小，最大為60°。除了神經學評估外，Morris水迷宮也可以用來評價大鼠神經功能的改變[19]。Morris水迷宮由一個直徑1.5 m、深0.3 m的水池和一個隱藏在水面以下(3 cm)的平臺組成，平臺位于第四象限。在光線昏暗的條件下，將大鼠放置于水中，測量水下平臺定位的時間，以測試大鼠神經認知視覺空間學習的記憶的損傷。

3.2 組織學研究 在對大鼠神經和運動功能進行評估后，處死大鼠進行組織學研究。根據需要分別取大鼠肺、腸、腦、肝及腎組織[13]。樣品用蘇木精和伊紅染色，采用Chiu’s法[20]對切片中觀察到的組織學改變進行評分，評估組織損傷程度。

3.3 生物化學分析 為了評估腎功能和肝功能，常需要測定血尿素氮、肌酐、天門冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶、堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶水平[18]。在CPB后采集血液，檢測血清中的d-乳酸、腸道脂肪酸結合蛋白和二胺氧化酶水平，以評價DHCA過程中腸道屏障的變化[21]。

3.4 炎癥因子和氧化應激指標檢測 采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清中炎癥因子水平，其中以腫瘤壞死因子、白細胞介素-1和白細胞介素-6的關系最為密切[22]。同時，檢測大鼠主動脈血中丙二醛、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的水平，有助于判斷DHCA對大鼠氧化應激反應的影響[23-24]。

4 大鼠DHCA模型的應用

近年來，大鼠DHCA模型被廣泛應用于臨床試驗。2014年，Bartels等[25]在一項CPB/DHCA大鼠模型的初步研究中，利用造影劑及MRI技術成功地檢測到腦毛細血管通透性增加，證明了使用分子分析結合臨床相關成像技術描述CPB/DHCA嚙齒動物模型中血腦屏障特征的可行性，為神經功能的測量等研究建立基礎。Yu等[26]為了全面了解DHCA手術對體內腎miRNA表達的影響，對大鼠建立了持續60 min的DHCA模型，取腎組織進行微陣列分析，其在DHCA大鼠中發現了異常的腎miRNA表達模式，并進一步討論了差異表達的miRNA是否與DHCA-AKI發病機制有關。Sgouralis等[27]在大鼠CPB期間，建立數學模型評估尿液氧分壓與內髓組織氧分壓平衡的程度，從而更好地了解腎中尿液和髓質氧分壓之間的關系。Ma等[28]為了探討一種膜聯蛋白a1生物活性肽(ANXA1sp)是否能夠解決神經炎癥并誘導sirtuin-3調控的細胞保護通路，其在大鼠DHCA模型的基礎上，進一步建立新型抽血性心臟驟停引發急性神經炎癥的實驗模型，并采用緊急保存復蘇法，成功地檢測ANXA1sp的神經保護作用及其機制。

5 結語

目前，DHCA中引起多種器官功能障礙的機制尚未闡明。建立大鼠DHCA模型不僅可以提高對潛在機制的認識，且可以在推進藥物試劑進入臨床試驗研究前分析其潛在的價值。隨著大鼠DHCA模型的不斷發展完善，新模型將有助于進一步研究DHCA的病理生理過程，探索中、長期DHCA后多器官功能障礙的機制，并可能在今后的研究中提出新的保護策略。