血清游離膽紅素測定的研究進展

譚煒富（綜述）李薇（審校）

暨南大學附屬東莞醫院新生兒科，廣東 523900

隨著我國全面二胎政策穩固推進，我國早產兒發生率及發生數明顯升高［1-2］。新生兒高膽紅素血癥發生率為60%～80%［3］，尤其以早產兒更為多見。作為臨床上不可忽視的問題，高水平游離膽紅素（unbound bilirubin，UB）對新生兒神經系統具有明顯的毒性作用，若不及時診治將發展為膽紅素腦病，可導致一系列神經系統后遺癥甚至死亡［4-6］。

1 膽紅素生理及神經毒性機制

膽紅素是人體血紅蛋白代謝后形成的四吡咯微黃色化合物，其中在人體血液中有4種不同的存在方式：未結合膽紅素（unconjugated bilirubin，UCB）、UB、結合膽紅素（conjugated bilirubin，CB）、delta膽紅素（δbilirubin，Bd）。膽紅素作為人體正常存在的物質，在一定濃度下，具有很強的抗氧化作用［7］。

然而，UB作為一種脂溶性物質，在其高水平時可穿透血腦屏障并沉積在中樞神經系統特定區域，導致該區域神經元壞死及黃染［8-9］。迄今為止，膽紅素神經毒性機制尚不清楚，尚有多項研究認為與多種細胞及分子通路參與有關，以上機制破壞細胞膜完整性及其功能、誘導神經元內質網應激、誘發線粒體及DNA損傷、影響神經突觸興奮性，最終導致神經元細胞凋亡、壞死［6，10-14］。

2 早產兒膽紅素腦損傷的表現

反復的氧飽和度降低以及呼吸暫停可能是急性膽紅素腦病（acute bilirubin encephalopathy，ABE）的唯一表現［6］，而早產兒具診斷意義的呼吸暫停有時可表現為皮膚黏膜“發紺”，無序的呼吸控制則是ABE患兒一個顯著特征。核黃疸時，膽紅素的神經毒性作用而可致早產兒罹患永久性的神經后遺癥，除了經典的核黃疸，即包括肌張力障礙及手足徐動型腦癱、聽力損害、眼球上轉運動障礙和牙釉質發育不良以外，還可因蝸后聽覺系統損害而表現為聽覺型核黃疸［15-16］。當膽紅素神經毒性表現為相對輕微的神經發育障礙，則多無典型核黃疸的表現，可有輕至中度的運動異常、肌張力障礙、感覺運動整合不協調等，稱為膽紅素誘導的神經功能障礙（bilirubin-induced neurological dysfunction，BIND）［17-18］。

除以上所述各類膽紅素腦損傷外，尚有一臨床棘手且不可預料的類型，即是較低膽紅素水平所致的核黃疸。此類患兒的血清膽紅素水平低于產生神經毒性所需的膽紅素水平，雖罕見但不容忽視［19］。

3 血清UB檢測方法

3.1 酶法 酶法檢測UB的研究眾多，其基本原理是膽紅素過氧化酶可催化膽紅素氧化以對其定量檢測。釩酸鹽氧化酶法通過釩酸將膽紅素氧化為膽綠素，對比傳統重氮法檢測膽紅素更簡單快速，且可用于含有干擾物質的樣品檢測［20］。而Andreu等［21］設計了一種使用膽紅素氧化酶/熒光素結合物的新技術同時對血清中的UB、白蛋白結合膽紅素和CB 3種類型膽紅素進行檢測分析。此種方法的酶經過修飾可在波長為487 nm和520 nm處有激發和發射熒光。然而，這種新方法的準確性及敏感性不足以用于臨床樣本的UB檢測。

Ahlfors等［22］運用區域流體系統通過過氧化物酶法測量血液中游離UCB，該方法通過使用小口徑管道構建一種由計算機控制的區域流體系統，實現了膽紅素檢測的自動化，避免了商業上獲得的過氧化物酶法的諸多限制。該方法精確度高，但受到酶穩定性的制約。

3.2 色譜法 精確檢測膽紅素量的色譜法眾多，而高效液相色譜法（HPLC）是目前可分離并直接測定4種不同膽紅素成分的最精確方法之一。Zelenka等［23］開發了基于高靈敏度HPLC的方法測定膽紅素，該方法僅通過簡單快速的樣品制備步驟即可檢測組織和體液中的膽紅素。新近的Martelanc研究團隊創新性地將高效液相色譜儀與熱透鏡光譜檢測（TLS）聯合對人類血清UB進行精確檢測，實驗證明HPLC-TLS檢測法擁有超高的靈敏度，檢測精度達到了pM水平，進行血清樣本檢測時無需進行處理即可加樣檢測［24-25］。然而，以上研究僅針對成人血清樣本進行探索，并沒有針對非成人樣本的研究數據。李建瑜與李薇［26］則在改進HPLC法的同時，開創性地測定了13例高膽紅素血癥新生兒，并測得此組患兒血清UB水平為（548.20±107.19）nmol/L，填補了此類研究在新生兒方面的數據空白。

3.3 電化學法 電化學法按有無酶促過程可分為兩類不同的檢測UB的方式，其一是非酶促方法，其二是運用膽紅素氧化酶（bilirubin oxidase，Box）的酶促生物傳感方法。

Box作為生物信號分子廣泛用于膽紅素的電化學測定中，其可催化膽紅素產生氧化還原指示劑過氧化氫，或可通過辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）間接反應而產生電位信號。有報道將Box與HRP同時固定在石墨-環氧基質上形成一種雙酶傳感器，可提供測定膽紅素的低電勢，運用該方法其膽紅素的檢測極限為4μM，線性范圍可達到10 mM［27］。有研究還通過運用電子傳遞介體（electron transfer mediators，ETM）以增強檢測的靈敏度［28］。Chauhan等［29］通過將Box共價固定于有氧化鋯涂層的二氧化硅納米粒子上，組成一種復合電極，通過這種電極可得到膽紅素檢測的極限值是0.1 nM。另外還有報道顯示，抗壞血酸氧化酶可代替Box作為生物信號分子用于電化學法測定膽紅素［30］。

關于非酶電化學方法測定膽紅素的報道很多。Yang等［31］運用分子印跡和表面溶膠-凝膠技術開發了新型高靈敏度石英晶體微天平傳感器，該傳感器對膽紅素具高度選擇性，其線性范圍為0.1～50.0μM，檢測限為0.05μM。

3.4 電泳法 毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）是一種高效的分離技術，僅需少量血清樣品即可進行快速檢測，可用于測定新生兒血清膽紅素［32-33］。有研究報道將CE與前沿分析（frontal analysis，FA）結合以確定混合溶液中UB及其與白蛋白結合的能力［34］。該研究還發現向膽紅素-白蛋白混合物添加阿司匹林可將膽紅素分離。此項成果可用于評價高膽紅素血癥患兒的殘余白蛋白結合能力，為新生兒膽紅素神經毒性風險管理提供新的思路。Nie與Fung［33］運用上述CE結合FA，開發了通過聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）多通道微流控芯片測定膽紅素及其白蛋白結合能力的床旁檢測儀器。這種儀器可在發生黃疸之前檢測UB的早期升高水平，而且成本低、檢測快速，可作于新生兒膽紅素床旁監測。

3.5 熒光法 熒光測定法在其發展階段，曾使用熒光標記的脂肪酸結合蛋白突變體作為探針，對UB具有高度的特異性和敏感性。Huber等［35］使用一種被標記了熒光分子丙烯酰胺的突變脂肪酸結合蛋白（BL22P1B11）并使其與膽紅素結合，而后其熒光被淬滅，可通過BL22P1B11-Rh裝置探測熒光的改變而做出響應。通過手持式游離膽紅素儀或實驗室熒光計，BL22P1B11-Rh探頭可進行1 min/次的測量，并提供精確的血清UB濃度值。Santhosh等［36］使用金納米簇作為熒光探針以檢測血清中UB。金納米簇對人血清白蛋白穩定，由于膽紅素與血清白蛋白的相互作用，將導致金納米簇的熒光猝滅。此項技術可用于無干擾膽紅素檢測，檢測限為（248±12）nM。該技術亦可用于比色檢測，加入過氧化氫后金納米簇將具過氧化物酶活性，可催化檢測樣品中UB成無色物質，可實現樣品的UB比色。

3.6 分光光度法 膽紅素可通過各種分光光度法進行測量。直接分光光度法是新生兒最常用的血清膽紅素的檢測方法，該方法在波長為454 nm和528 nm處進行測量［37］。因膽紅素在波長454 nm處被吸收，而血紅蛋白在454 nm及528 nm處均等吸收，故波長528 nm處的吸光度與454 nm處的吸光度的差值即是膽紅素的吸光度。然而，因其檢測的不精確性，限制了該方法在出生3周以內新生兒的運用。有課題組針對自動進樣進行了新的探索。Vichapong研究團隊開發了同時進樣有效混合流系統（simultaneous injection effective mixing flow analysis，SIEMA）用以測定尿液中的尿膽素原和膽紅素，此系統由進樣泵、連接器、固定線圈、混合線圈和光譜儀組成，通過此系統的4個通道可分別檢測膽紅素及尿膽素原（尿膽素原和膽紅素的檢測限分別為1.0 mg/L和0.003 mg/L）［38］。

3.7 壓電技術 石英晶體微量天平（quartz crystal microbalance，QCM）作為壓電原理的應用之一，可用于檢測物質細微的質量變化。因其具有高靈敏度、靈活便攜、價格實惠的優點，也可用于進行UB的檢測。聯合運用分子印跡技術與QCM技術可以開發具有高度選擇性和更為靈敏的膽紅素檢測系統［39］。Yang等［31］基于分子印跡和表面溶膠-凝膠技術，通過壓電方法對將膽紅素印跡的二氧化鈦膜修飾到石英晶體上，開發出了用于測定膽紅素的新型QCM傳感器。此種方法具有高選擇性、高靈敏度、高可重復性，其響應時間僅30 min，檢測膽紅素線性范圍在0.1～50.0μM，檢測限為0.05μM。有研究則通過分子印跡技術，在QCM芯片表面上合成膽紅素印跡聚合物納米膜，所制得的QCM傳感器可用于檢測人血漿膽紅素時，其檢測限和定量限分別為0.45μg/ml和0.9μg/ml［40］。

4 結 語

高水平的UB對新生兒尤其是早產兒具有顯著的神經毒性，可造成嚴重神經系統損傷，導致殘疾甚至死亡。血清UB因可通過血腦屏障并誘導神經元凋亡、壞死，故及時檢測新生兒血清UB至關重要。目前針對新生兒血清UB的檢測方法眾多，可分為酶法、色譜法、電泳法、熒光法、分光光度法和壓電技術等，每種方法都有其特點及適用條件。臨床兒科醫生或檢驗人員在進行對新生兒血清UB進行檢測時，應根據具體實際對檢測方法進行選擇，以期獲得更好的檢測結果，優化新生兒高膽紅素血癥及早產兒膽紅素腦損傷的防治方案。