缺血再灌注損傷下微囊泡抑制心肌細胞凋亡的研究進展

常冀楊 孟曉菲 周佳奇 黃開越 張清潭

1濱州醫學院附屬醫院老年醫學科，山東 256600；2濱州醫學院附屬醫院骨關節與運動醫學科，山東 256600

隨著人口老齡化，心肌組織的缺血再灌注損傷（如心肌梗死、心力衰竭）已被公認為是導致死亡的重要原因之一。據世界衛生組織統計，到2020年，缺血性心臟病將成為最常見的致死性疾病之一［1］。恢復血液再灌注可有效減少缺血性心臟損害，但值得注意的是，心肌組織的血液供應恢復后常發生心肌再灌注損傷，并可能引起不可逆的損害［2］。目前已知的缺血再灌注損傷的可能機制包括氧化應激、炎癥、內皮細胞功能障礙等［3-4］，并最終導致細胞死亡。凋亡作為細胞程序性死亡方式之一，目前被認為是細胞缺血再灌注損傷中最為重要的分子機制。而凋亡的發生同樣依賴于許多病理生理過程，如炎癥、氧自由基的增加、線粒體損傷等。研究者們過去常常關注上述病理機制，希望從中尋求新的治療思路。然而近十年來，最新研究發現微囊泡同樣也參與了缺血再灌注所誘導的細胞凋亡，并且在其中發揮重要作用。

研究發現，當細胞受到外界刺激或發生凋亡時，微囊泡將從不同類型的細胞質膜中釋放出來。同時，微囊泡可以傳遞信號，并作為介導細胞通訊的系統信使誘發一系列細胞形態和（或）功能改變［5］，從而導致細胞凋亡。當然，細胞的凋亡不完全基于缺血再灌注損傷的直接刺激，受刺激的細胞可以通過釋放微囊泡間接作用于正常的外周細胞，從而進一步促進周圍其他的細胞凋亡［6］。換言之，在微囊泡的參與下，可放大細胞凋亡。然而令人驚訝的是，在某些特定條件下，微囊泡的增多可抑制缺血再灌注導致的心肌細胞凋亡，從而發揮其保護作用［7］，且這一作用越來越受到關注。本篇綜述中，我們概括了微囊泡在細胞缺血再灌注損傷中的形成及特征，進一步總結了微囊泡抑制心肌細胞凋亡的可能分子機制，并初步歸納了微囊泡在缺血再灌注相關的心臟疾病中的作用，為缺血性心臟病的治療提供了新思路。

1 微囊泡與缺血再灌注損傷

1.1 微囊泡 微囊泡是一類直徑在100～1 000 nm的球形結構分子［8］，通過質膜出芽釋放出的可以表達原始細胞特有的抗原磷脂囊泡。盡管先前研究將微囊泡作為惰性碎片，認為其形成代表著一種生理現象，但是越來越多的試驗證據表明，多種病理過程與微囊泡的顯著增加有關。微囊泡可被各種類型的細胞所釋放，并且根據所釋放細胞來源和狀態而在成分上有所不同。例如，在細胞損傷、炎癥、血栓形成和血小板活化期間，外周血中循環的微囊泡數量會顯著增加［9］。目前研究表明，微囊泡通常在外界刺激下形成于質膜內富含脂質的微區中［10］，如細胞內鈣超載可以觸發微囊泡的形成，隨后磷脂進行不對稱重排［11-12］，膜破裂后可激活鈣敏感酶，從而促使膜蛋白脫離細胞骨架結構，最后形成微囊泡［13］。其中，凋亡型微囊泡的形成關鍵取決于Rho相關激酶ROCK I，其在凋亡過程中通過半胱天冬酶介導的裂解而被激活［9］。ROCK I可以激活肌球蛋白輕鏈的磷酸化和肌動蛋白-肌球蛋白絲與質膜的偶聯，從而誘導細胞骨架重排至微囊泡的形成。盡管我們尚未完全準確了解微囊泡形成的確切機制及各種細胞群體之間所釋放的微囊泡類型不同的原因，但由此可以推測，細胞骨架重組或代表了微囊泡的形成關鍵步驟。隨著越來越多相關試驗的進展，我們已經發現微囊泡能夠攜帶大量的蛋白質、脂質及各種核酸（例如RNA和DNA），使微囊泡可以通過將具有生物活性的分子轉移到周圍細胞來介導細胞間的“交流”。正由于微囊泡參與了不同的生物學過程，由微囊泡介導的細胞凋亡在各種疾病的發生和發展中起著重要作用，包括細胞間通訊、信號轉導和免疫調節。例如，張磊［14］證實了從人類胚胎神經干細胞釋放的微囊泡通過介導高表達的熱休克蛋白70有效抑制了心肌細胞凋亡。此外，經該類微囊泡干預后可增加內皮細胞間連接蛋白的表達，從而減少內皮細胞凋亡并誘導增殖［15］。除了攜帶蛋白質之外，由于微囊泡富含諸如鞘磷脂、磷脂等脂質，因此微囊泡具有比原始細胞更穩定的結構。存在于微囊泡表面的溶血性磷脂酰膽堿（LPC）與循環免疫球蛋白M耦聯，進而與凋亡細胞結合，使微囊泡與凋亡細胞一起被清除［16］。迄今為止，對微囊泡所釋放的不同類型的RNA的研究較為廣泛。其中，對微小RNA（miRNA）的研究最多。一項大鼠模型的研究表明，微囊泡能夠將遺傳物質、轉錄因子傳遞至受體細胞并轉化其表型［17］。在腫瘤細胞系中，微囊泡治療降低了癌細胞生存能力、增加了癌細胞的凋亡水平，并降低了B細胞淋巴瘤2蛋白的表達及線粒體膜電位［18］。Rhodes等［19］研究表明，微囊泡中攜帶miRNA含量可能因疾病而異。一方面，他們發現與患有穩定性冠心病患者相比，微囊泡增強了急性冠脈綜合征患者中促炎性miRNA（miR-19、miR-21、miR-146、miR-155和miR-223）的表達水平。另一方面，源自內皮前體干細胞的微囊泡可以促進內皮細胞修復，以上過程正是由于微囊泡攜帶促血管生成的miRNA引起的［20-21］。綜上所述，正是由于既能夠參與細胞之間的通訊以維持生理平衡，又能協助介導傳遞體內誘導疾病的信號，我們可以將微囊泡看作是成為未來各類疾病的潛在治療手段。

1.2 微囊泡與心肌細胞缺血再灌注損傷 心肌細胞的缺血再灌注是許多心血管疾病的病理生理基礎，如心肌梗死和心力衰竭。細胞凋亡是缺血再灌注后心肌細胞死亡的主要機制之一。在缺血再灌注損傷下，微囊泡在缺血再灌注損傷過程中數量增加，可能導致內皮功能障礙、白細胞黏附、血小板活化等現象。已有多項試驗證明了經微囊泡處理干預后會顯著加重心肌細胞缺血再灌注損傷［22］及血管內皮功能障礙［23］。值得注意的是，微囊泡作為一把“雙刃劍”，在缺血再灌注損傷中的所發揮的作用不盡相同，不僅取決于其釋放細胞的微環境，而且還取決不同的細胞來源［24］。Wang等［7］研究發現由缺血條件下心肌細胞釋放的微囊泡顯著減少了心肌梗死的面積和凋亡心肌細胞的數量，從而驗證了微囊泡的保護作用。此外，有研究表明miR-22攜帶的間充質干細胞釋放的微囊泡可保護心肌細胞免受缺血再灌注損傷［25］。而人類胚胎神經干細胞可以釋放攜帶熱激蛋白70的微囊泡，這類微囊泡的釋放也可以起到抑制心肌細胞凋亡的作用［14］。由于釋放細胞的微環境、攜帶物質的種類和來源細胞的差異，微囊泡的功能均有所不同。在缺血再灌注損傷中，微囊泡不僅顯示出促進細胞凋亡的作用，更顯示出保護性心肌細胞的作用。因此，在缺血后再灌注期間攜帶大量“信號貨物”而被釋放出的微囊泡與心肌細胞凋亡密切相關。

2 微囊泡抑制缺血再灌注條件下心肌細胞凋亡的機制

大量研究表明，在缺血再灌注損傷體內、外模型中，微囊泡均可通過不同的機制抑制凋亡從而發揮保護作用［26］，而這一發現有望使微囊泡在缺血性心臟疾病的治療上成為一種新型治療方法。在此，我們總結了微囊泡抑制缺血再灌注條件下心肌細胞凋亡的可能機制。

2.1 內質網應激途徑 內質網作為不同蛋白質和脂質的生物合成場所，為細胞穩態維持和凋亡提供了主要區域［27］。在細胞應激條件下，包括缺血再灌注損傷、缺氧等，都可能導致內質網功能障礙，也就是眾所周知的內質網應激［28-29］。越來越多的證據表明，當細胞受到刺激時，未折疊蛋白質反應可以在缺血再灌注損傷的心肌細胞中被激活應答內質網應激條件［30］。GRP78作為主要的內質網的分子伴侶，是未折疊蛋白質反應的主要調節劑，心肌細胞中GRP78經缺血再灌注誘導可激活心肌細胞中Akt信號通路，從而保護細胞免受缺血再灌注損害［31］。在大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，來自缺血預處理后釋放的微囊泡被證實通過抑制內質網應激對在缺血再灌注條件下的心肌細胞凋亡存在抑制作用。經缺血預處理后，研究人員檢測到心肌細胞中半胱天冬酶3、9、12的活性也顯著下降，而且TUNEL染色顯示陽性細胞核的百分比和數量均降低。通過蛋白質印跡分析證實，在經缺血預處理后釋放的微囊泡能夠使GRP78的表達明顯上調［32］。還有其他研究也闡述了微囊泡可以降低細胞凋亡程度，然后通過內質網途徑控制了GRP78的表達，從而保護心肌細胞的結構和功能。另外，血小板所釋放的微囊泡也被證實參與了大鼠后肢經缺血再灌注預處理的心臟保護作用，經預處理后的血小板、內皮細胞、紅細胞、大鼠后肢細胞釋放出的微囊泡均能夠通過抑制內質網應激減少細胞的凋亡［33］。此外，研究表明，在缺血再灌注損傷期間，缺血的心肌細胞釋放的微囊泡可顯著減少心肌梗死的面積，并通過內質網應激途徑減少心肌細胞的凋亡。與試驗組相比，缺血再灌注后心肌細胞所釋放微囊泡治療組的肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）活性明顯降低。同時，半胱天冬酶12作為一種在內質網應激表達的公認的標志物，在心肌中的表達也同樣顯著降低［7］。維持鈣穩態對于線粒體和內質網的正常功能也同樣至關重要。眾所周知，心肌缺血再灌注損傷可引起細胞內鈣超載，進一步致心肌損傷甚至細胞凋亡。大量研究發現，調節心肌細胞中鈣的濃度主要取決于網狀Ca2+-ATP酶（SERCA2），此外，p-PLB是SERC2的調節蛋白的磷酸化形式。SERCA2與細胞中鈣濃度的調節緊密相關，它可將鈣從細胞的胞質中轉運至內質網中。有試驗表明，在凋亡過程中正常心肌功能受損并伴有SERCA2表達降低時，更多的鈣離子會滯留在胞質中［34］。研究表明，在經微囊泡治療后，GRP78、SERCA2和p-PLB的表達顯著增加［7］。綜上所述，心肌細胞釋放的微囊泡通過內質網途徑介導鈣穩態來發揮保護作用，從而抑制缺血再灌注損傷中的心肌細胞凋亡。

2.2 miRNA易位途徑 過去被視為細胞碎片的miRNA，隨著近些年來研究的深入，科學家們發現其參與了各種生理和病理過程，目前在科研界受到極大的關注。有研究表明從內皮干細胞釋放的微囊泡可以攜帶miRNA從而抑制細胞凋亡。例如，通過轉運保護性miRNA，如miR-126和miR-296，微囊泡降低了細胞受缺氧（缺血）的影響，從而保護細胞免受缺血再灌注損傷［20］。眾所周知，急性心肌缺血/再灌注導致心肌細胞凋亡，并進一步導致左心室重構和進行性心力衰竭。多能干細胞（iPS細胞）起源于重新分化的體細胞，目前正作為基于干細胞療法的一種極有發展前景的手段受到人們的廣泛關注。Wang等［7］研究證明，可以在心肌細胞中明顯觀察到多能干細胞釋放的微囊泡抑制缺血再灌注損傷誘導的氧化應激，從而保護心肌細胞免于凋亡。此外，分別由Nanog和低氧誘導因子-1（HIF-1）調節的心臟保護性miR-21和miR-210在多能干細胞釋放的微囊泡中高度富集，并能夠被有效傳遞至心肌細胞。這些發現表明，微囊泡通過抑制缺血性心肌細胞中半胱天冬酶3、7的活化而顯著減少了心肌細胞的損傷，這在一定程度上是攜帶特定的miRNA（例如miR-21和miR-210）的保護結果［35］。Yu等［25］研究結論也支持類似的結果，他們發現由微囊泡轉運的miR-221/222在間充質干細胞中的表達增高，可相對保護更多細胞免于凋亡。綜上所述，以上結論證明了心肌細胞免受缺血再灌注損傷的保護作用是由miR-221介導的，而該保護序列部分由間充質干細胞衍生的微囊泡所轉運。

3 缺血再灌注相關心臟病中的微囊泡

包括急性冠脈綜合征和心力衰竭在內的缺血性心臟病仍是全世界死亡和致殘的主要原因之一［36］。研究表明，對缺血性心臟病最有效的治療方法之一是及時進行再灌注治療。但是，再灌注會導致進一步的心肌細胞損傷，通常被稱為是心肌缺血再灌注損傷。本綜述闡述了微囊泡在缺血再灌注損傷后釋放并觸發各種不同的細胞信號傳導途徑，從而影響細胞的凋亡。基于以上分子層面的研究，已有研究者將此應用于缺血再灌注體外模型，并發現微囊泡可發揮一定的保護作用。例如，Giricz Z等證實缺血再灌注損傷大鼠中經缺血預處理心肌細胞產生的微囊泡治療后可以減少心肌梗死的面積。另外一項臨床試驗中，Zhou等［37］還證實了在接受經皮冠狀動脈介入治療（PCI）后的ST段抬高型心肌梗死患者中，來自各種細胞來源的微囊泡水平與變化的時程不盡相同。試驗結果顯示，PCI后微囊泡的水平顯著增加，并且在48 h達峰值，這表明微囊泡的增多可能在PCI術后患者的心臟中也發揮保護性的作用。此外，微囊泡的治療還可以用于檢測藥物的臨床療效。例如，血管內皮細胞釋放的微囊泡水平的升高可反映血管內皮損傷，研究提示與應用10 mg阿托伐他汀相比，40 mg阿托伐他汀可以降低缺血性心臟病患者循環內血管內皮細胞釋放微囊泡的水平，這表明循環中微囊泡的顯著下降與內皮功能的改善密切相關。同時，有研究指出，當血管內皮細胞處于促凋亡狀態時，可能會破碎成微囊泡，故血管內皮細胞水平的降低可能是由于其微囊泡脫落所致，也增加了除傳統危險因素外的主動脈的硬化程度［38］。因此受損的血管內皮細胞生成和其釋放的微囊泡生產可能是導致缺血性損傷加重的機制。近年來的研究和臨床試驗已經初步證實了微囊泡在缺血再灌注相關疾病中的重要作用，而這也為微囊泡作為靶向治療缺血性心臟病的新策略提供理論基礎。

4 小 結

本篇綜述主要概括了微囊泡在細胞缺血再灌注損傷中的形成及特征，并進一步總結了微囊泡抑制心肌細胞凋亡的可能分子機制，并初步歸納了微囊泡在缺血再灌注相關的心臟疾病中的作用。研究發現在缺血性疾病中，源自不同來源的微囊泡的釋放在疾病的發病機制中起著重要的作用。隨著缺血性心臟病成為人類目前主要的死亡原因之一，我們迫切需要針對缺血性心臟病患者的新型治療策略。微囊泡之所以引起了人們極大的興趣，正因為它們作為各種疾病的信號或生物標志物，具備能夠將多種蛋白質或遺傳物質遞送至心肌細胞發揮保護作用的潛在治療價值。微囊泡已被證實參與心肌細胞缺血性損傷的調節，并且還保護心肌細胞免于凋亡。盡管近年來已經有不少學者在研究微囊泡形成的機制，但微囊泡如何精確靶向特定組織仍有待商榷。雖然越來越多的證據展示了基于微囊泡的治療可以受到巨大獲益，但目前仍缺乏針對缺血性心臟病中微囊泡的實用價值研究。因此，作為缺血性心臟疾病治療可能的新方向，更多關注的重點在于進行各種臨床試驗以評估微囊泡作為缺血性心臟病的潛在治療方法的可行性。