BFAR 在膠質瘤中的表達及其與膠質瘤預后的關系

程 哲，汪潮潮，吳 娟，王 棒，周星辰

（蚌埠醫學院第二附屬醫院神經外科，安徽 蚌埠 233000）

膠質瘤（glioma）為最常見的原發性中樞性神經系統的惡性腫瘤，具有高致死致殘率[1-3]，其中膠質母細胞瘤（GBM）的發病率最高，占原發中樞系統惡性腫瘤的46.1%。盡管目前膠質瘤的診療技術不斷更新，包括最大范圍內的腫瘤切除術聯合放化療、基因靶向治療、免疫治療及電場療法等，但膠質瘤患者平均生存期僅為12 個月，且5 年生存率不足5%[4-7]，因此，研究膠質瘤的發病機制尤為重要。雙功能凋亡調節器（bifunctional apoptosis regulator，BFAR），其可以調控凋亡信號通路，一方面其能促進Bcl-2 和Bcl-XL 的相互作用，同時其也可以直接或間接與Caspase-8 和Caspase-10 的前體作用，從而阻礙Fas介導的凋亡信號通路[8]。研究表明[9]，BFAR 在組織中的表達具有高度特異性，在腦組織中為高表達。但目前關于BFAR 與起源于腦組織的膠質瘤研究較少，基于此，本研究通過腫瘤相關數據庫來分析BFAR在膠質瘤中組織標本中的表達情況以及其與膠質瘤患者臨床預后之間的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據庫分析 使用癌癥基因組圖譜（cancer genome atlas，TCGA）在線數據庫（GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn/） 分 析BFAR 在 低 級 別 膠 質 瘤（LGG）及膠質瘤母細胞瘤（GBM）中的表達，應用中國腦膠質瘤基因圖譜（Chinese glioma genome atlas，CGGA，http：/www.cgga.org.cn）數據庫分析BFAR 在各個級別膠質瘤中的表達情況。

1.2 材料 人腦膠質瘤細胞U251、T98 和LN229 由蘇州大學附屬第二醫院腦神經實驗室惠贈；正常人腦星形細胞株NHA 購于合肥希研生物公司；細胞培養液DMEM 及胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司；Trizol試劑購于上海Sangon Biotech 公司；RIPA、PMSF 試劑及BCA 試劑盒購于上海碧云天公司；BFAR 及GAPDH 引物由上海Sangon Biotech 合成；EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 及TransStart Tip Green qPCR Super Mix 購 于TRANS 公司；BFAR、GAPDH 一抗購于中國ABclonal公司；二抗（羊抗兔）購于BIOMIKY 公司。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR） 提取細胞總RNA，測定RNA 濃度。根據試劑盒中步驟：在每個反應中加入2.0 μg RNA，70 ℃溫浴3 min，取出后冷卻至室溫，加0.5 μl 逆轉錄酶后置于37 ℃水浴60 min。20 μl 反應體系中含2 μl cDNA，在Roche Light Cycler96 儀器上進行45 個循環反應，按照94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s。設3 個重復組，結果以2-ΔΔCT值計算。BFAR 及GAPDH 的引物如下：BFAR 正向，5'-GAGTTTGCTTGGGACTGGTTGGAG-3'，反 向，5'-GAGGCACGGTCTTCAGTTCACTTC -3'；GAPDH 正向，5'-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'，反向，5'-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3'，以GAPDH 的mRNA表達水平作為內參。

1.4 Western Blot 提取細胞總蛋白，BCA 法測蛋白質濃度，配置8%的分離膠，5%的濃縮膠；每孔上樣10 μl，分別以濃縮膠80 V，30 min，分離膠120 V，1 h電泳；200 mA 濕轉2 h；1% BSA 室溫下封閉1 h；一抗：BFAR（1∶1000）、GAPDH（1∶1000）4 ℃孵育過夜，二抗：1∶10000 室溫下孵育1 h；ECL 曝光顯影。

1.5 統計學方法 數據統計采用GrapPad Prism 8 及SPSS 17.0 軟件處理，計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，生存分析采用Log-Rank 檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BFAR 在膠質瘤中的表達情況 基于TCGA 數據庫分析顯示，低級別膠質瘤BFAR 的表達高于非瘤腦組織（P＜0.05）；膠質母細胞瘤BFAR 表達高于非瘤腦組織（P＜0.05），且隨著膠質瘤惡性程度增加，BFAR 的表達量增加，見圖1。

2.2 BFAR 在膠質瘤中的預后情況 BFAR 低表達的膠質瘤患者總體生存時間長于BFAR 高表達的膠質瘤患者（P＜0.05）；高表達BFAR 的高級別膠質瘤患者總體生存期短于低表達BFAR 的高級別膠質瘤患者（P＜0.05）；異檸檬酸脫氫酶（IDH）野生型膠質瘤患者BFAR 表達高于IDH 突變型患者（P＜0.05）；非1p/19q 聯合缺失的膠質瘤患者BFAR 表達高于1p/19q 聯合缺失的患者（P＜0.05），見圖2。

2.3 BFAR 在膠質瘤中與凋亡相關基因表達的相關性 基于TCGA 數據庫分析顯示，膠質瘤中BFAR與抗凋亡相關蛋白Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1 表達及促凋亡相關蛋白Bax、Bad、Bim 表達密切相關（P＜0.05），見圖3。

2.4 BFAR 在膠質瘤細胞中表達情況 BFAR 蛋白在膠質瘤細胞U251、T98 和LN229 中的表達比正常星形膠質細胞NHA 中高（P＜0.05）；定量PCR 顯示，BFAR mRNA 在膠質瘤細胞U251、T98 和LN229 中的表達比正常星形膠質細胞NHA 中高（P＜0.05），見圖4。

圖1 BFAR 在膠質瘤中的表達情況

圖3 膠質瘤中BFAR 的表達與凋亡相關基因的關系

圖4 膠質瘤細胞中BFAR 表達情況

3 討論

膠質瘤具有高度的侵襲性和致死性，雖然臨床上治療方式不斷更新，但患者的總體預后仍較差[10]。因此，在膠質瘤的發病機制及相關藥物治療中需積極探索尋找新的基因或者通路來調控膠質瘤的生長及侵襲[11]。BFAR 為凋亡調控相關基因，然而有關其在膠質瘤中的研究甚少。

本研究基于TCGA 數據庫分析顯示，低級別膠質瘤BFAR 的表達高于非瘤腦組織（P＜0.05）；膠質母細胞瘤BFAR 表達高于非瘤腦組織（P＜0.05），且隨著膠質瘤惡性程度增加，BFAR 的表達量增加；且BFAR 低表達的膠質瘤患者總體生存時間長于BFAR 高表達的膠質瘤患者（P＜0.05）；高表達BFAR的高級別膠質瘤患者總體生存期短于低表達BFAR的高級別膠質瘤患者（P＜0.05），提示膠質瘤中BFAR 的表達情況可以作為其預后判斷的指標之一。異檸檬酸脫氫酶家族包括IDH1、IDH2 和IDH3這3 種異構酶，膠質瘤多伴有IDH1、2 的突變，而伴有IDH 突變的膠質瘤患者往往預后較好[12]。少突膠質細胞瘤中染色體1p/19q 聯合性缺失最為常見，1p/19q 聯合缺失的膠質瘤患者總生存期和無進展生存期較長[13-15]。大量研究表明膠質瘤一旦合并IDH突變及1p/19q 聯合缺失其對放化療更敏感。本研究中異檸檬酸脫氫酶（IDH）野生型膠質瘤患者BFAR表達高于IDH 突變型患者（P＜0.05）；非1p/19q 聯合缺失的膠質瘤患者BFAR 表達高于1p/19q 聯合缺失的患者（P＜0.05），提示膠質瘤中IDH 突變及1p/19q 聯合缺失可使膠質瘤患者對放化療更敏感，因此BFAR 影響膠質瘤預后很有可能與膠質瘤的放化療相關。

BFAR 被認為可以調控凋亡信號通路，一方面可以作用于抗凋亡相關基因，另一方面可以調控于促凋亡相關基因，其對凋亡信號的調控處于動態平衡狀態。本研究基于TCGA 數據庫分析顯示，膠質瘤中BFAR 與抗凋亡相關蛋白Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1表達及促凋亡相關蛋白Bax、Bad、Bim 表達密切相關（P＜0.05），但關于膠質瘤中BFAR 調控凋亡相關通路及基因的機制還需要大量基礎研究進一步探索。此外，本研究結果顯示，BFAR 蛋白在膠質瘤細胞U251、T98 和LN229 中的表達比正常星形膠質細胞NHA 中高（P＜0.05）；定量PCR 顯示，BFAR mRNA 在膠質瘤細胞U251、T98 和LN229 中的表達比正常星形膠質細胞NHA 中高（P＜0.05），提示BFAR在膠質瘤細胞中表達上調。

綜上所述，BFAR 在膠質瘤中表達上調且與膠質瘤患者的預后密切相關，其中與促凋亡及抗凋亡相關基因表達關系密切。然而BFAR 在膠質瘤中是如何調控凋亡通路及其與膠質瘤的耐放化療之間的關系都需要進一步的研究，其很有可能成為膠質瘤治療的靶點基因。