1-甲基-4-苯基-1，2，3，6 四氫吡啶誘導小鼠嗅覺障礙的實驗研究

張 欣，王 偉，司偉岳，魏一冉，李 靜，袁良杰

（1.山東第一醫科大學/山東省醫學科學院基礎醫學院，山東 泰安 271000；2.泰安市第一人民醫院神經內科，山東 泰安 271000）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一種以黑質多巴胺能神經元進行性減少為主要病理特征的中樞神經退行性疾病，其臨床表現為靜止震顫、肌強直、運動遲緩和步態不穩為主要特征的運動癥狀[1，2]。近年來，越來越多的研究報道PD 的臨床表現除經典的運動癥狀之外，還表現為以嗅覺障礙、便秘、情緒異常和睡眠障礙為主的非運動癥狀，其中嗅覺障礙的發生率最高，達70%～90%[3，4]。目前嗅覺障礙的發病病因及病理機制比較復雜，如基因突變、α-突觸核蛋白病變、神經遞質異常、神經免疫系統紊亂、環境影響等因素[5]。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6 四氫吡啶（l-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）為目前PD 研究中應用較多的實驗神經毒素。大量研究發現[6-8]，MPTP 的制備的PD 慢性模型和亞急性模型能夠誘導小鼠的嗅覺障礙。基于此，本研究采用小鼠腹腔注射MPTP 制備PD 急性模型，探討MPTP 誘導對PD 小鼠嗅覺功能的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗使用SPF 級10 周左右雄性健康C57BL/6 小鼠，體重20～25 g，由安徽常州卡文斯實驗動物有限公司提供。小鼠在溫度18 ℃～22 ℃和12 h/12 h 晝夜循環光照條件下飼養。小鼠自購買后在本實驗室適應性飼養1 周后進行PD 小鼠模型制備。整個實驗流程完全遵循山東第一醫科大學實驗動物倫理學的規定[批號：SYXK（魯）20190022]。

1.2 實驗試劑及配置 MPTP 購自美國sigma 公司，使用0.9%無菌生理鹽水溶解MPTP，配成10 mg/ml MPTP，每只小鼠15 mg/kg，給藥方式采用腹腔注射。兔抗-COX-2 抗體和兔抗-iNOS 抗體購自abcam 公司。

1.3 方法 將小鼠隨機分為對照組和MPTP 組，每組6 只，MPTP 組腹腔注射MPTP（15 mg/kg），每2 h 注射1 次，共4 次，同樣方法給予對照組注射生理鹽水，注射5 d 后進行行為學檢測，嗅聞識別行為學實驗結束后取雙側的小鼠嗅球，稱重，并檢測炎性因子COX-2 和iNOS 蛋白的變化。

1.3.1 嗅聞識別行為學實驗 首先，將對照組和MPTP 組小鼠放在新墊料中飼養3 d。然后，于第4天將小鼠生活的籠子里另一半換上新墊料，另一半為小鼠生活的舊墊料。實驗開始時，將小鼠放在新舊墊料之間，檢測系統自動記錄3 min 內小鼠在新舊墊料分別活動的時間。如小鼠不能辨別自己生活過的舊墊料的味道而是在新墊料區域停留的時間更長，表明小鼠出現了嗅覺功能障礙。

1.3.2 樣本處理與Western Blot 實驗 嗅聞識別實驗結束后，將小鼠用8%的水合氯醛麻醉，然后用粗剪刀將小鼠斷頭剝去皮毛層，使用細剪刀將小鼠顱前部輕輕剪開，雙側嗅球充分暴露置于干冰，用彎鑷小心分離出雙側嗅球置于已提前稱重的EP 管中進行稱重。在一側嗅球的EP 管中加入蛋白裂解液（每1 mg 加入100 μl 的蛋白裂解液）。將小鼠樣品置于冰上，進行電動勻漿，勻漿至組織完全裂解為止，然后靜置40 min，4 ℃，12，000 r/min 離心20 min。小心吸取上清液置于新的EP 管中，每個樣本吸取1 μl 蛋白樣品用于濃度測定，將余下的蛋白樣品加入5X 蛋白上樣緩沖液，置于95 ℃金屬浴加熱器中孵育5 min，冰上靜置10 min。每個樣品取15 μg 上樣并進行電泳分離出不同分子量蛋白。電泳結束后在將蛋白在300 mA、90 min 條件下轉至PVDF 膜上。轉膜結束后，將PVDF 膜浸潤于5%的脫脂奶粉封閉90 min，4 ℃搖床一抗孵育24 h，然后將二抗孵育PVDF 膜，90 min，用發光液進行顯影。利用ImageJ 軟件讀取COX-2，iNOS 與β-actin 蛋白條帶的灰度值。

1.4 統計學方法 應用GraphPad Prism 5.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MPTP 對小鼠雙側嗅球重量的影響 注射5 d后，兩組左側和右側嗅球重量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 MPTP 處理小鼠對小鼠雙側嗅球重量的影響（，mg）

2.2 MPTP 對小鼠嗅覺識別功能的影響 對照組小鼠嗅聞舊墊料時間長于嗅聞新墊料時間，差異有統計學意義（P＜0.05）。MPTP 組小鼠嗅聞新舊墊料時間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；MPTP 組嗅聞舊墊料時間短于對照組，嗅聞新墊料時間長于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 MPTP 處理小鼠后對嗅覺識別功能的影響（，s）

表2 MPTP 處理小鼠后對嗅覺識別功能的影響（，s）

2.3 MPTP 對小鼠嗅球炎性因子COX-2 和iNOS 蛋白表達的影響 注射5 d 后，MPTP 組嗅球COX-2、iNOS 蛋白表達高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 MPTP 對小鼠嗅球COX-2 和iNOS 蛋白表達的影響（）

表3 MPTP 對小鼠嗅球COX-2 和iNOS 蛋白表達的影響（）

3 討論

嗅覺功能障礙是PD 最早的非運動特征之一，約在90%的早期PD 病例中存在，早于運動癥狀的出現數年[9]。誘發PD 患者嗅覺障礙的原因極其復雜，主要涉及到遺傳因素、環境因素、重金屬中毒和病毒感染等[10]。目前制備PD 模型研究最多外源性藥物是1-甲基-4-苯基-1，2，3，6 四氫吡啶（l-methy-4-phenyl-l，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）[11，12]。研究表明[13]，鼻內接觸MPTP 能夠有效的誘導PD 患者的嗅覺障礙，導致小鼠嗅覺喪失以及與帕金森病相似的連續認知和運動改變，但作用時間較短。采用MPTP 制備PD 模型包括急性PD 模型、亞急性和慢性PD 模型，研究表明[14]，MPTP 制備PD 慢性模型和亞急性模型均可誘發PD 的嗅覺功能障礙。本研究采用MPTP 腹腔注射制備小鼠PD 急性模型，結果發現在注射MPTP 第5 天小鼠出現嗅覺障礙，表明腹腔注射MPTP 制備小鼠PD 急性模型能夠誘導PD 的前期非運動癥狀嗅覺功能障礙。

嗅覺功能障礙多表現為嗅覺減退及喪失，嗅覺損害具體表現為氣味辨別、識別、察覺的全面受損，而且氣味識別的損害比氣味察覺的損害更早、更加嚴重[15]。研究表明[16，17]，其主要的發病機制可能與神經炎性、線粒體功能異常、氧化應激、泛素一蛋白酶體系統功能障礙、興奮性氨基酸毒性作用及細胞凋亡等有關。本研究結果發現，對照組小鼠嗅聞舊墊料時間長于嗅聞新墊料時間，差異有統計學意義（P＜0.05）；MPTP 組小鼠嗅聞新舊墊料時間比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示腹腔注射MPTP 后小鼠不能分辨新舊墊料的氣味，表明小鼠的嗅覺功能受到損傷，說明MPTP 制備的PD 急性小鼠模型能夠誘導小鼠的嗅覺功能障礙。研究表明[18]，腹腔注射MPTP 5 d 后導致中腦多巴胺能神經元損傷，證實MPTP 能夠激活小鼠中腦黑質區的星形膠質細胞，釋放炎性因子COX-2 和iNOS 等促炎蛋白酶[19]。COX-2 是PGE2 的合成限速酶，PGE2 可以在膠質細胞中調控IL-6 等炎性因子的表達[20]。iNOS 為誘導性一氧化氮合酶，誘導NO 的釋放，NO 是一種參與多種生理過程的分子信使，在腦出血，腦水腫及神經退行性疾病中加速神經元的損傷[21]。本實驗結果顯示，MPTP 組嗅球COX-2、iNOS 蛋白表達高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示腹腔注射MPTP 導致嗅球區炎性因子COX-2 和iNOS 蛋白表達升高，表明MPTP 導致小鼠嗅覺障礙可能與炎癥反應有關。

綜上所述，MPTP 制備PD 急性小鼠模型能夠誘導小鼠的嗅覺功能障礙可能與膠質細胞的炎癥反應有關。