膽汁中趨化因子C-X3-C-基元受體1和可溶性CD40配體在肝移植術后肝損傷中的預測價值

楊鵬翔，高玉雪，劉 歡，沈昀泰，臧運金，陳德喜,

1 青島大學 醫學部， 山東 青島 266071； 2 青島大學附屬醫院 器官移植中心， 山東 青島 266003;3 首都醫科大學附屬北京佑安醫院 北京市肝病研究所， 北京 100069

目前肝移植是各種慢性終末期肝病、肝惡性腫瘤的有效治療方法[1]。在肝移植過程中肝損傷的發生在所難免，由于供體肝切取、冷保存、手術再植入以及開放血流再灌注等過程可導致術后初期肝功能不良[2]。肝功能障礙可能是肝移植損傷過程中先天免疫系統引起的全身炎癥和氧化應激反應[3]。許多研究[2,4-6]結果顯示細胞因子參與肝移植和急性肝損傷后的炎癥反應，在肝移植術后肝損傷的發生發展中有重要作用。本研究擬分析肝移植患者膽汁中細胞因子的水平，并結合臨床指標探討其對肝移植術后肝損傷程度的預測價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月—12月青島大學附屬醫院器官移植中心收治的16例肝移植患者，根據術后第1天ALT水平分為輕度肝損傷組(ALT<500 U/L)和重度肝損傷組(ALT>500 U/L)。

1.3 主成分分析(principal component analysis，PCA) 對膽汁中細胞因子以及膽汁中細胞因子與臨床指標結合進行PCA分析，明確膽汁中細胞因子和臨床指標對肝損傷程度的影響。

1.4 GO富集分析 GO分析是對細胞因子功能注釋以及識別生物學特性的生物信息分析方法。采用R語言中的clusterProfiler包對膽汁中細胞因子進行GO富集分析。

1.5 倫理學審查 本研究方案經由青島大學附屬醫院倫理委員會審批，批號：QDFYKYLL-2018-12-008，患者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 16例肝移植患者中，男12例，女4例，年齡33～61歲。主要肝移植病因：肝癌患者8例，肝炎或肝硬化患者7例，肝衰竭患者1例。輕度肝損傷組10例，重度肝損傷組6例。

2.2 不同時間點兩組患者血清ALT、AST、LDH水平比較 肝移植術后第1天，重度肝損傷患者AST、ALT和LDH水平均明顯高于輕度肝損傷患者，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。在肝移植術后第1、3、5、7天，AST、ALT和LDH呈逐漸降低的趨勢，且AST較ALT更容易恢復正常(表1)。

表1 不同時間點兩組患者ALT、AST、LDH水平變化

2.3 兩組患者膽汁中細胞因子水平比較 肝移植術后第1天，重度肝損傷組患者的趨化因子C-X3-C-基元受體1(Fractalkine)、可溶性CD40配體(soluble CD40 ligand，sCD40L)、IL-4、趨化因子CXCL10(chemokine CXCL10，IP-10)和巨細胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein 1 alpha，MIP-1α)表達水平明顯高于輕度肝損傷組，差異均有統計學意義(Z值分別為-2.828、-2.850、-2.398、-2.475、-1.844，P值分別為0.003、0.008、0.017、0.023、0.043)(表2)。

表2 輕度肝損傷與重度肝損傷膽汁中細胞因子比較

2.4 預測肝移植術后肝損傷程度的ROC曲線分析 結果顯示Fractalkine、sCD40L、AST的ROC曲線下面積分別為0.933(0.812～1.000)、0.833(0.589～1.000)、0.917(0.779～1.000)，提示術后第1天膽汁中Fractalkine和sCD40L以及AST對肝移植術后肝損傷程度有明顯預測價值。

2.5 臨床指標與膽汁中細胞因子的關系 相關性分析結果顯示，肝移植術后第1天，AST、ALT和LDH與膽汁中多個細胞因子呈正相關(P值均<0.05)(表3)。

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表3 臨床指標與膽汁中細胞因子的相關性

2.6 膽汁中細胞因子和臨床指標對肝損傷程度的影響

PCA分析結果顯示，肝移植術后第1天膽汁中細胞因子結合血清中ALT、AST水平可以將肝移植術后輕度與重度肝損傷患者較好地進行區分(圖1)。

注:a, 膽汁中細胞因子; b, 膽汁中細胞因子結合臨床指標。圖1 PCA結果分析

2.7 GO富集分析 GO分析結果顯示， 膽汁中細胞因子與外部刺激的正反饋調節、細胞趨化性、受體配體活性、細胞因子活性、細胞因子-細胞因子受體相互作用有關(圖2)。

注:a, 生物過程; b, 細胞組分; c, 分子功能。圖2 GO富集分析結果

3 討論

肝移植術后肝損傷是肝移植失敗的重要原因之一[7]。肝損傷所導致的急慢性炎癥反應對肝移植手術的成功起著至關重要的作用，眾多細胞因子與趨化因子參與炎癥反應[8]。早發現、早干預肝損傷的發生，對提高肝移植患者生活質量及預后具有重要意義。臨床上常見的肝損傷標志物有ALT、AST、LDH[9-10]，早在1956年就發現ALT是肝損傷更好的標志物[11]。相比于AST，ALT在身體其他部位的濃度更低，且能夠更加特異地反映肝損傷的程度[12]。研究[12-13]表明，在92%的供體器官中，ALT的峰值<500 U/L，以血漿ALT的水平作為分組依據，可以評價早期移植物的功能和患者的生存率。本研究主要揭示了肝移植術后膽汁中細胞因子在不同程度肝損傷中的變化及其與臨床指標的關系，并探究膽汁中細胞因子成分對肝損傷的預測作用。

Fractalkine作為一種趨化因子參與調節炎癥和免疫反應，在急性或慢性肝損傷中的水平增高[14-15]。Fractalkine在肝實質細胞的再生和炎癥反應中起著調節作用[16]。與同系移植相比，IP-10和Fractalkine在異體移植術后第3天高表達，提示二者在移植后早期的免疫反應中起重要作用[17]。

原發性肝癌患者肝移植后高水平sCD40L與早期病死率密切相關[18]。在非酒精性脂肪性肝病和原發性膽汁性肝硬化中，sCD40L水平與健康對照組相比無顯著差異[19]。血清IP-10水平與丙型肝炎肝移植術后早期纖維化相關[20]。促炎細胞因子和趨化因子如Fractalkine、IL-1、IL-4、G-CSF和單核細胞趨化因子-1等可促進輔助性T淋巴細胞17和CX3CR1+單核細胞浸潤，驅動小鼠肝損傷的炎癥反應[21-23]。本研究顯示，肝移植術后重度肝損傷患者膽汁中Fractalkine和sCD40L均高于輕度肝損傷組；IL-4、IP-10、MIP-1α在嚴重肝損傷時也有升高。Fractalkine與ALT呈正相關，sCD40L與ALT、AST、LDH均呈正相關(P值均<0.05)。聯合ROC曲線分析結果顯示，術后膽汁中Fractalkine、sCD40L的升高對于肝損傷的早期預測具有提示意義。膽汁中細胞因子水平的升高反映了患者炎癥反應的激活，并為預測不同病因移植患者的肝功能潛在異常提供了理論依據。常規的肝損傷指標達檢測上限，在時間上存在一定的延后性，隨后僅能根據ALT的增加對已發生肝損傷患者進行對癥支持治療[24]，由于肝移植術后膽汁的獲取更加快捷便利，因此探究膽汁中更早的無創肝移植術后損傷標志物對于肝損傷的早期預警非常有意義。AST和LDH較ALT，更容易恢復正常，提示肝移植是一種外部刺激，細胞因子及其配體激活，在炎癥反應中起重要作用。而膽汁中細胞因子與外部刺激的正反饋調節、細胞因子活性、細胞因子-細胞因子受體相互作用等有關。遺憾的是，在這項研究中，沒有動態檢測血清細胞因子，未能揭示膽汁和血清細胞因子之間的相關性。

總之，該研究提示膽汁中Fractalkine和sCD40L可能是預測肝移植術后肝損傷潛在的標志物。膽汁中細胞因子聯合臨床指標能更好的預測肝移植術后肝損傷的程度。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：楊鵬翔、高玉雪負責資料分析，撰寫論文；劉歡、沈昀泰參與收集標本；臧運金負責指導撰寫文章；陳德喜負責課題設計，擬定寫作思路，并最后定稿。