以石斛為例研究多基原及非藥用目標(biāo)選育品種的質(zhì)量差異△

王秋玲，劉倩倩，袁鳳霞，盧奇奇，丁志鵬，胡宏，魏建和*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.陜西國際商貿(mào)學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院，咸陽 陜西 710026

多基原藥材是指多個(gè)物種同時(shí)作為一種藥材使用，不利于實(shí)現(xiàn)中藥質(zhì)量的穩(wěn)定、可控，產(chǎn)生的原因包括地域資源限制、物種區(qū)分困難等。《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版收錄的618種藥材及飲片中，多基原藥材有158種，占總數(shù)的25.6%，涉及的中成藥處方占比可達(dá)85%，可見其影響面巨大[1-2]。與此同時(shí)，還有一種形式的“多基原”一直未能引起人們的重視，即在同一物種層面非藥用目標(biāo)選育獲得的品種，如觀賞用芍藥、油用玫瑰、蔬果用百合及大量茶用菊花種質(zhì)。其中，白芍、牡丹皮、百合等少數(shù)藥材已經(jīng)形成了主流的藥用種質(zhì)，鮮見混用；其余多數(shù)還沒有明確的藥用種質(zhì)，不同用途種質(zhì)混作藥用，給藥品質(zhì)量帶來隱患。

石斛類藥材是存在上述隱患的典型代表之一。《中國藥典》2015年版收載鐵皮石斛和石斛2種藥材。鐵皮石斛基原為鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo，而石斛基原為金釵石斛D.nobileLindl.、霍山石斛D.huoshanenseC.Z.Tang et S.J. Cheng、鼓槌石斛D.chryotooxumLindl.或流蘇石斛D.fimbriatumHook.的栽培品及其同屬植物近似種，數(shù)量眾多。以鐵皮石斛、金釵石斛為代表的藥用石斛自20世紀(jì)90年代才開始人工生產(chǎn)；而園藝界石斛產(chǎn)業(yè)起步于19世紀(jì)。在英國皇家園藝協(xié)會(RHS)登記的新品種每年超百個(gè)，其親本融合的原生種達(dá)數(shù)十個(gè)，還有大量已經(jīng)流通但尚未登記的品種，形成了根據(jù)開花季節(jié)劃分的“春石斛”和“秋石斛”兩大類商品，在東南亞地區(qū)具有較大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)。“春石斛”主要由產(chǎn)自我國的金釵石斛與亞熱帶地區(qū)其他原生種培育而成。“秋石斛”以原產(chǎn)澳大利亞的蝴蝶石斛D.phalaenopsisFitzg.為主要親本雜交而成。觀賞石斛常以切花的形式被餐飲業(yè)用作擺盤裝飾，取走花葶后的大量老莖則成為廢品而流入了藥用市場。近年來，石斛類盆花在國內(nèi)也開始受到消費(fèi)者的喜愛。由于鐵皮石斛提高免疫力的功能已經(jīng)得到普及，普通消費(fèi)者極易誤認(rèn)為石斛均能提高免疫力。關(guān)于不同來源物種的石斛化學(xué)成分、藥效學(xué)已有報(bào)道[3-9]，但納入非藥用目標(biāo)選育品種一起進(jìn)行比較的研究尚未見報(bào)道。本研究對比石斛屬6個(gè)原生種、12個(gè)觀賞石斛品種及1種石斛類藥材中近緣易混品金石斛Flickingeriacomata(Bl.) Hawkes.間的質(zhì)量差異，為石斛藥用種質(zhì)使用及類似現(xiàn)象藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

全部石斛原生種材料取材于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所本草生態(tài)溫室，觀賞石斛材料由東方迦南蘭花產(chǎn)業(yè)有限公司提供。樣品經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所王秋玲副研究員鑒定，信息見表1。全部樣品為2年生新鮮健壯莖枝，采用50 ℃低溫烘干，期間揉搓多次至葉鞘搓凈，干燥。

表1 石斛樣品信息

1.2 試藥

對照品無水葡萄糖(批號：160207，純度>99%)、石斛堿(批號：160512，純度>98%)、毛蘭素(批號：160305，純度>98%)、石斛酚(批號：160307，純度>95%)、天冬氨酸(批號：160218，純度>99%)均購于上海融合醫(yī)藥有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、三羥甲基氨基甲烷、硫酸慶大霉素(批號：E003632—10G)均購于美國 Sigma 公司；枯草芽孢桿菌[批號：CMCC(B)63501-2a22-1]、大腸埃希菌[批號：CMCC(B)44102-3a24-2]、金黃色葡萄球菌[批號：CMCC(B)26003-5a29-1]、白色念珠菌[批號：CMCC(F)98001-2a15-3]購于中國食品藥品檢定研究院；改良馬丁培養(yǎng)基(批號：HB5222)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號：HB4114-19)購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；SA緩沖液(上海源葉生物有限公司)；2%壓積羊血細(xì)胞(SRBC)、10% SRBC、1%雞紅細(xì)胞(鄭州九龍生物制品有限公司)；文齊試劑(天津市現(xiàn)代高科技研究院中山研究所)；溴甲酚紫(天津市巴斯夫化工有限公司)；Giemsa 染液、Hanks 液、補(bǔ)體(豚鼠血清)均購于北京耀威振興科技有限公司；無支原體小牛血清(浙江天航生物科技有限公司)；其余試劑為分析純。

1.3 儀器

UV1700PC型紫外-可見分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)；6890N型氣相色譜儀(美國安捷倫公司)；UltiMate 3000 型高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)；1525/2487型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；GZX-GF101-3-BS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；AL-204和AL201型分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；LXJ-ⅡB型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HWS26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；UPH-I-20T型優(yōu)普系列超純水器(成都超純科技有限公司)；THC型數(shù)控超聲波提取機(jī)(濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司)；FW-100型高速萬能粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋[三洋電機(jī)(中國)]；DL-CJ-2NDI型潔凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；DH-250型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司)；Bio-TekELX800 型光吸收酶標(biāo)儀(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)；CX23 型生物顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物

BALB/c小鼠[SPF級，斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司]84只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證編號：SYXK(京)2013-0023。

2 方法

2.1 化學(xué)成分分析

選擇石斛屬中已有報(bào)道具有活性的5種主要成分進(jìn)行測定，分別是多糖、石斛堿、毛蘭素、石斛酚和總氨基酸[10-18]。其中，多糖、石斛堿、毛蘭素的含量測定分別按照《中國藥典》2015年版中鐵皮石斛、金釵石斛和鼓槌石斛的含量測定方法[1]。石斛酚含量測定參照參考文獻(xiàn)[19]報(bào)道方法，采用分散液-液微萃取與高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)測定。總氨基酸含量測定參照參考文獻(xiàn)[20]報(bào)道方法，以天冬氨酸為對照品，采用茚三酮顯色，分光光度法測定。全部樣品3次重復(fù)。

2.2 體外抗氧化活性

2.2.1供試藥液制備 取每種石斛粉末(過三號篩)0.5 g，加50%乙醇50 mL中加熱回流2 h，冷卻抽濾，重復(fù)提取2次，合并濾液濃縮蒸發(fā)，定容至50 mL；每種石斛樣品重復(fù)3次。

2.3 正常小鼠免疫調(diào)節(jié)活性

2.3.1供試藥液制備 分別精密稱取NS1和ODA3的干燥藥材100 g，剪為約1 cm小段，采用純水熱回流提取3次，濾液濃縮至黏稠，加入80%體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，24 h后抽濾，濾渣進(jìn)行真空冷凍干燥后，分別得石斛多糖粉末34.5、28.2 g備用。

2.3.2動物分組及給藥方式 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為7組，包括NS1多糖溶液高、中、低劑量組，ODA3多糖溶液高、中、低劑量組及空白對照組，每組12只。2種石斛多糖溶液的高、中、低劑量組每日分別給藥0.8、0.4、0.2 g·kg-1，每只小鼠每日灌胃給藥0.2 mL，對照組小鼠每天按給藥的液體量，進(jìn)行純水灌胃，持續(xù)30 d后，頸椎脫臼處死，取樣。

2.3.3測定指標(biāo)與方法 按參考文獻(xiàn)[25]中免疫調(diào)節(jié)功能產(chǎn)品檢測指標(biāo)的建議與方法，測定小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、體液免疫功能中血清溶血素，單核巨噬細(xì)胞功能中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅血細(xì)胞吞噬率。其中，采用全自動酶標(biāo)儀代替分光光度計(jì)進(jìn)行血清溶血素測定[26]。

2.4 體外抑菌活性

2.4.1供試藥液制備 精密稱取NS1和ODA3粉末(過四號篩)，分別以等量水、50%乙醇和85%乙醇為提取溶劑，回流提取得浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮，得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水相部位，冷凍干燥后研磨，得各活性部位粉末，密封冷藏備用。

2.4.2測定指標(biāo)與方法 采用紙片法測定2種石斛不同提取物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的抑菌能力。分別用胰酪大豆胨培養(yǎng)基接種大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌，改良馬丁培養(yǎng)基接種的白色念珠菌，制成帶菌培養(yǎng)皿。臨用前用無菌水與各干燥粉末分別配成質(zhì)量濃度0.5 mg·mL-1的提取液，其中醇溶性部位在使用前加入去離子水制成混懸液，取6 mm直徑滅菌濾紙圓片30份在各提取物液體中浸泡2 h，晾干后分別平鋪于接種帶菌培養(yǎng)皿中，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，測定抑菌圈直徑，計(jì)算抑菌率[27]。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同來源石斛樣品中化學(xué)成分含量

全部樣品的多糖、石斛堿、毛蘭素、石斛酚、氨基酸含量測定結(jié)果見表2。總體來看，5種成分在不同來源石斛樣品之間的差異較大。19個(gè)樣品均檢測到多糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低為1.33%，最高為32.69%，相差超20倍。其中，6個(gè)石斛屬原生種中僅有NS1的多糖含量達(dá)到了《中國藥典》2015年版規(guī)定限量。觀賞石斛中4種秋石斛(ODA2、ODA3、ODA6、ODA7)中的平均多糖含量也達(dá)到了《中國藥典》2015年版限量標(biāo)準(zhǔn)，且有2種與鐵皮石斛差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10個(gè)樣品的石斛堿含量均低于檢測限，其余9個(gè)樣品中最低為0.04%、最高為1.02%，相差26倍。其中，NS2的石斛堿含量與其他8個(gè)樣品(3個(gè)原生種和5個(gè)觀賞石斛)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)為NS5的石斛堿含量高于金釵石斛，其余7個(gè)樣品均顯著低于金釵石斛，且未達(dá)到《中國藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)。17個(gè)樣品的毛蘭素含量低于檢測限，1種觀賞石斛(ODS4)中檢測到微量(0.01%)，另1個(gè)為鼓槌石斛(NS6)達(dá)到1.56%。8個(gè)樣品的石斛酚含量低于檢測限，其余11個(gè)樣品中最低為0.02%，最高為0.23%，相差超10倍，其中春石斛和秋石斛中分別有1種的石斛酚含量較高，其余均小于0.2%。19個(gè)均檢測到總氨基酸，最低為0.01%，最高為1.78%，相差超100倍，含量高的前5個(gè)樣品來自秋石斛類群。

對比不同類群石斛間的差異，NS1與NS2之間的多糖、石斛堿、石斛酚、總氨基酸含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。金石斛屬易混品(NS7)分別與鐵皮石斛和金釵石斛之間的多糖、石斛堿、石斛酚、總氨基酸含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。金釵石斛與其他4種(NS3～NS6)同樣可作為石斛藥材使用的原生石斛相比，測定的5種成分中至少有2種成分含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。全部12個(gè)觀賞石斛與NS1或NS2的5種成分比較，存在至少2種成分含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 不同來源石斛樣品多糖、石斛堿、毛蘭素、石斛酚、總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

續(xù)表2

3.2 不同來源石斛樣品體外抗氧化活性

表3 不同來源石斛樣品體外抗氧化活性

3.3 鐵皮石斛與觀賞石斛免疫調(diào)節(jié)功能對比

各組小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅血細(xì)胞吞噬率及血清溶血素變化見表4。由表4可知，各組小鼠平均體質(zhì)量與空白對照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在對小鼠免疫器官胸腺和脾臟質(zhì)量的影響方面，NS1高劑量組的脾臟指數(shù)顯著高于空白對照組，其余均與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在調(diào)節(jié)非特異性免疫功能(巨噬細(xì)胞吞噬活性)和特異性免疫功能半數(shù)溶血值(HC50)方面，NS1和ODA3的活性存在明顯差異，表現(xiàn)為與對照組相比，NS1高、中劑量組能顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力(P<0.05)，并顯著增加小鼠的HC50(P<0.05)，2種作用均隨劑量加大而增強(qiáng)。ODA3高、中、低劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力均與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而高、中劑量可顯著降低小鼠的HC50(P<0.05)。

3.4 鐵皮石斛與觀賞石斛抑菌功能對比

2種石斛不同提取部位的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知，NS1和ODA3對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌均無抑制作用，對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌均具有抑制作用，但都沒有達(dá)到硫酸慶大霉素對照的效果。ODA3 50%醇提物的正丁醇部位對大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用效果較好，抑菌圈直徑分別達(dá)11.67、12.00 mm；NS1 85%醇提物水層對大腸埃希菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)10.67 mm，50%醇提物的石油醚萃取部位對枯草芽孢桿菌的抑制作用較強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)12.00 mm。

對比NS1與ODA3之間的差異情況，ODA3全部提取部位對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌均具有抑制作用，而NS1分別有2個(gè)提取部位對大腸埃希菌沒有抑菌效果，3個(gè)提取部位對枯草芽孢桿菌沒有抑菌效果。NS1與ODA3的相同提取部位之間，在分別作用于大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌上分別有5個(gè)部位和4個(gè)部位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，共9個(gè)顯著差異組中8個(gè)為ODA3抑菌效果好于NS1，1個(gè)NS1作用更強(qiáng)。

4 討論

4.1 多基原藥材的質(zhì)量差異問題

本研究通過對比不同來源石斛類藥材質(zhì)量可知，單一基原的鐵皮石斛與藥材石斛的多個(gè)基原物種，以及易混偽品金石斛之間均存在差異，支持鐵皮石斛作為獨(dú)立的藥材。但石斛藥材5個(gè)原生基原物種間的化學(xué)成分、體外抗氧化活性方面存在顯著差異，同樣入藥可能對臨床療效有較大影響。

《中國藥典》2015年版收載的158種多基原藥材中，約有2/3以上的種類都已經(jīng)解決了人工生產(chǎn)技術(shù)，但大部分都沒有形成人工生產(chǎn)規(guī)模，栽培資源還沒有完全取代野生資源。石斛中金釵石斛就是代表，是歷代本草公認(rèn)的物種，也早已實(shí)現(xiàn)了人工生產(chǎn)技術(shù)的突破，貴州赤水地區(qū)還形成了一定的生產(chǎn)規(guī)模。然而，由于標(biāo)準(zhǔn)允許多基原的存在，野生采集、進(jìn)口補(bǔ)充，甚至非藥用品種的低價(jià)沖擊，致使金釵石斛人工生產(chǎn)潛力沒有得到充分挖掘。與此同時(shí)，《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ、《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(征求意見稿)》已把石斛屬所有物種都列入，迫切需要從資源利用角度建立行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。由此，筆者認(rèn)為，唯有在標(biāo)準(zhǔn)制訂和原料選擇時(shí)，少一些對資源現(xiàn)狀的妥協(xié)，市場自然會促進(jìn)最優(yōu)品種的野生變家種生產(chǎn)，人工生產(chǎn)規(guī)模的提升不能等到野生資源無法供應(yīng)，甚至達(dá)到瀕危時(shí)才進(jìn)行。

表4 2種石斛多糖不同劑量對小鼠免疫功能指標(biāo)的影響

表5 NS1與ODA3不同萃取部位體外抑菌實(shí)驗(yàn)抑菌圈直徑 mm

4.2 非藥用目標(biāo)選育品種的質(zhì)量差異問題

《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(修訂稿)》中提出“禁用人工干預(yù)產(chǎn)生的種間雜交品種”[28]。利用不同物種進(jìn)行雜交育種是園藝、食品育種界常用的方法，但最易帶來質(zhì)量的改變，特別是發(fā)揮藥效、引起不良反應(yīng)的成分都未充分明確的藥材。如陳皮來源于橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種，但由于果業(yè)的發(fā)展，市場流通的陳皮常來源于橘和非《中國藥典》2015年版物種橙等的雜交品種，如“貢柑”“椪柑”“春見”等，沖擊了陳皮的質(zhì)量[29]。在整個(gè)屬都能作為法定石斛來源使用的前提下，大部分觀賞石斛均為屬內(nèi)不同種雜交而來，基原混雜的問題較為普遍。

在本研究分析的全部觀賞石斛品種中，至少有1種成分與鐵皮或金釵石斛存在顯著差異。研究選擇多糖含量達(dá)《中國藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)的秋石斛品種ODA3與鐵皮石斛進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)和體外抑菌活性對比，結(jié)果顯示，兩者的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力和HC50存在顯著差異，表現(xiàn)為相對于對照組鐵皮石斛具有增強(qiáng)免疫功能的作用，而觀賞石斛存在抑制作用。兩者的體外抑菌活性也表現(xiàn)出部分提取部位間存在顯著差異，說明觀賞石斛作為鐵皮石斛使用應(yīng)慎重。