UPLC同時測定疏風解毒膠囊中10個化學成分含量

王日成

中國科學技術大學 附屬第一醫院，安徽 合肥 230001

疏風解毒膠囊是由虎杖、連翹、板藍根、柴胡、敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草8味中藥制備而成的復方制劑，具有疏風清熱、解毒利咽的功效，臨床用于發熱、惡心、咽痛、頭痛、鼻塞、流濁涕、咳嗽等急性上呼吸道感染屬風熱證及流感的防治，體內外研究表明，其療效確切[1-2]。現行質量控制標準為國家食品藥品監督管理局標準(YBZ00652009)，采用薄層掃描法測定虎杖中大黃素的含量[3]。但疏風解毒膠囊中多種化學成分已被證實有明確藥理活性，如方中虎杖[4](虎杖苷、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、大黃酚)具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效，連翹[5](連翹苷、連翹酯苷A)具有清熱、解毒、散結、消腫的功效，馬鞭草[6](馬鞭草苷)具有涼血、散瘀、通經、清熱、解毒、止癢、驅蟲、消脹的功效，甘草[7](甘草酸銨)具有清熱解毒、祛痰止咳、脘腹的功效，故僅以大黃素做為唯一質控指標難以全面體現疏風解毒膠囊的內在質量。現有文獻資料[8-11]采用高效液相色譜法(HPLC)測定疏風解毒膠囊中的虎杖苷、馬鞭草苷、連翹苷等成分，尚未有采用超高效液相色譜法(UPLC)同時定量測定疏風解毒膠囊中多種成分的文獻報道。本研究采用UPLC測定疏風解毒膠囊中馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、大黃酚10個指標成分含量，以期全面、有效評價其質量，完善質量評價標準，為進一步的臨床研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC超高效液相色譜系統(美國Waters公司)；ABS-135S型電子天平(d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司)；AS1001K型數控超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯公司)。

1.2 試藥

對照品連翹苷(批號：110821-201615，純度：94.9%)、連翹酯苷A(批號：111810-201707，純度：97.2%)、蘆薈大黃素(批號：110795-201609，純度：98.1%)、大黃酸(批號：110757-201607，純度：99.3%)、甘草酸銨(批號：110731-201720，純度：97.7%)、大黃素(批號：110756-201512，純度：98.7%)、大黃酚(批號：110796-201520，純度：99.2%)均購自中國食品藥品檢定研究院；馬鞭草苷(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：M-042，純度≥98%)；虎杖苷(成都曼思特生物科技有限公司，批號：A0052，純度：98%)；大黃素8-O-葡萄糖苷(成都克洛瑪生物科技有限公司，批號：130822，純度≥98%)。

疏風解毒膠囊由安徽濟人藥業有限公司提供，批號分別為160511、160922、170204、170516、170709、170715、170824、180104、180514；甲醇、乙腈均為色譜純(默克公司)；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTMC18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～3 min，10%A；3～6 min，10%～30%A；6～11 min，30%～40%A；11～17 min，40%～80%A；17～19 min，80%A；19～20 min，80%～10%A)；流速為0.3 mL·min-1；檢測波長為250 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、大黃酚適量，加甲醇超聲溶解并定容，制成分別含馬鞭草苷0.545 mg·mL-1、虎杖苷1.082 mg·mL-1、連翹苷0.213 mg·mL-1、連翹酯苷A0.636 mg·mL-1、蘆薈大黃素0.381 mg·mL-1、大黃素8-O-葡萄糖苷0.035 mg·mL-1、大黃酸0.079 mg·mL-1、甘草酸銨0.793 mg·mL-1、大黃素0.561 mg·mL-1、大黃酚0.018 mg·mL-1的混合對照品溶液(以上對照品質量濃度已按對照品純度折算)，室溫避光保存，備用。

精密吸取混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分別置10 mL量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 疏風解毒膠囊20粒，取內容物混合均勻，精密稱定約1.0 g，置100 mL圓底燒瓶中，加入稀乙醇50 mL，稱定質量，加熱回流提取2 h，冷卻后稱定質量并用稀乙醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液，室溫避光保存。

2.3 方法學考察

2.3.1系統適用性試驗 分別精密吸取2.2項下的供試品溶液、混合對照品溶液及空白溶劑，按2.1項下色譜條件測定，結果10個化學成分均可達到基線分離，與相鄰色譜峰之間的分離度>1.5，理論塔板數按虎杖苷計>15 000，對稱因子均小于1.2，空白溶劑對測定結果均無干擾。色譜圖見圖1。

注：A.供試品；B.混合對照品；C.空白樣品；1.馬鞭草苷；2.虎杖苷；3.連翹苷；4.連翹酯苷A；5.蘆薈大黃素；6.大黃素8-O-葡萄糖苷；7.大黃酸；8.甘草酸銨；9.大黃素；10.大黃酚。

2.3.2線性關系考察 取2.2.2項下系列混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以質量濃度對峰面積進行線性回歸，計算10個化學成分回歸方程和相關系數(r)，見表1。

表1 疏風解毒膠囊中10種化學成分的回歸方程及線性范圍

精密量取2.2.1項下混合對照品溶液，用稀乙醇倍比稀釋，按2.1項下液相色譜條件分析，取各成分峰信噪比S/N為10時的混合對照品溶液濃度為定量限(LOQ)，結果馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素和大黃酚LOQ分別為4.33、6.08、3.27、3.49、3.81、0.024、1.36、2.99、2.73、0.51 μg·mL-1。

2.3.3精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件重復進樣6次，記錄色譜圖并計算10個化學成分峰面積RSD。結果馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素8-O-葡萄糖苷、甘草酸銨、大黃素、大黃酚峰面積RSD分別為0.33%、0.26%、0.19%、0.57%、0.43%、0.48%、0.32%、1.01%、0.97%、0.71%(n=6)，儀器精密度符合要求。

2.3.4穩定性試驗 取同一供試品溶液(批號：20180526)，分別于0、4、8、12、16、20、24 h按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖并計算10個成分峰面積RSD。結果馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、大黃酚峰面積RSD分別為1.64%、1.72%、1.00%、2.14%、1.51%、2.62%、1.84%、1.50%、2.21%、2.25%(n=7)，表明供試品溶液24 h內穩定。

2.3.5重復性試驗 取同一批供試品(批號：20180526)內容物6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖及峰面積，按外標法計算10個成分含量及其RSD。結果馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、大黃酚平均質量分數分別為8.171、16.232、3.198、9.547、5.713、0.529、1.122、11.895、8.417、0.272 mg·g-1，RSD分別為0.74%、0.56%、0.28%、0.77%、0.92%、1.11%、0.78%、0.66%、0.49%、1.40% (n=6)，表明該方法重復性良好。

2.3.6加樣回收率試驗 精密稱取2.3.5項下已知含量供試品9份，每份約0.5 g，分成3組，精密稱定，分別加入含馬鞭草苷(1.641 mg·g-1)、虎杖苷(3.245 mg·g-1)、連翹苷(0.638 mg·g-1)、連翹酯苷A(1.889 mg·g-1)、蘆薈大黃素(1.141 mg·g-1)、大黃素8-O-葡萄糖苷(0.106 mg·g-1)、大黃酸(0.225 mg·g-1)、甘草酸銨(2.378 mg·g-1)、大黃素(1.681 mg·g-1)、大黃酚(0.054 mg·g-1)混合對照品溶液2.0、2.5、3.0 mL，按2.2.2項下方法處理，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，計算10個化學成分加樣回收率及相應RSD。結果馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、大黃酚平均加樣回收率分別為104.37%、97.35%、100.50%、101.02%、102.42%、100.16%、104.27%、100.84%、98.14%、99.79%；RSD分別為0.40%、0.98%、0.41%、0.56%、0.83%、1.00%、0.58%、0.88%、0.91%、0.71% (n=9)。見表2。

表2 疏風解毒膠囊10個成分的加樣回收率試驗結果(n=9)

續表2

2.4 樣品含量測定

取9批供試品，按照2.2.2項下條件處理，按2.1項下色譜條件平行進樣3次，記錄色譜圖及相應峰面積，照外標法計算10個化學成分含量，結果見表3。

表3 疏風解毒膠囊10個成分含量測定結果(n=3) mg·g-1

3 討論

3.1 質量評價指標成分的選擇

疏風解毒膠囊中虎杖為君藥，含有虎杖苷及蒽醌類成分大黃素、大黃酚等；連翹為臣藥，含有木脂素類連翹苷和苯乙醇苷類連翹酯苷A、連翹酯苷E等；馬鞭草為方中佐藥，含有環烯醚萜類成分戟葉馬鞭草苷和馬鞭草苷；甘草為方中使藥，含有甘草酸銨、甘草次酸及黃酮類成分甘草苷，筆者經UPLC多次實驗分析，最終選擇藥效確切、性質穩定、色譜響應值高且分離效果好的馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、大黃酚10個化學成分做為質量研究指標。

3.2 色譜柱選擇

本實驗分別比較不同品牌UPLC色譜儀(Agilent 1290 Infinity型UPLC色譜儀、Waters ACQUITY UPLC系統)和色譜柱(Thermo SyncromisTMC18(100 mm×3.0 mm，1.7 μm)、ACQUITY UPLCTMC18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、ZORBAX Eclipse plus C18(150 mm×2.1mm，1.8 μm)對10個化學成分含量結果的影響，結果各成分色譜峰分離度均符合規定，含量測定結果RSD均小于2.0%，方法耐用性良好。

3.3 供試品溶液制備方法選擇

本實驗對樣品提取方法(超聲30 min、回流2 h、索氏提取3 h)、提取溶劑(甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%乙醇、水)分別進行考察，超聲不能完全提取出10種化學成分，且糖類等成分對分析結果影響較大，回流和索氏提取方法結果差異無統計學意義，但回流所需時間短、易于操作，故選擇70%乙醇回流提取2 h作為供試品處理方法。

3.4 色譜條件選擇

本研究考察流動相以甲醇、乙腈作為有機相，0.05%甲酸、0.05%磷酸、0.1%甲酸、0.2%甲酸作為水相，結果乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫時分離效果最佳，基線平穩，保留時間適中，各色譜峰峰形較好。

本研究采用二極管陣列檢測器210～400 nm全波長掃描，結果顯示，馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素和大黃酚在250 nm處均有最大吸收，基線平穩、靈敏度高，故選擇250 nm為檢測波長。

4 結語

本研究建立UPLC同時測量疏風解毒膠囊中的馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、大黃酚10個成分的含量，與HPLC相比不僅增加檢測指標、縮短分析時間、減少溶液消耗，極大降低分析成本，提高了檢驗效率[12]，且經精密度、穩定性、重復性、加樣回收率等方法學考察均符合要求，結果準確、快速、可靠，可做為疏風解毒膠囊質量評價的有效方法。