一珠二化合物組合化學法合成喹唑啉酮類化學庫及其抗肺癌活性的初步篩選

王 瓊，鄭錦鴻，王錦芝，劉瑞武

(1.汕頭大學醫學院化學教研室，廣東 汕頭 515041；2.加州大學戴維斯分校生物化學和分子醫藥系，加利福尼亞 戴維斯 95817)

近年來小分子酪氨酸激酶抑制劑等分子靶向抑癌藥物的應用，為提高非小細胞肺癌患者遠期生存率提供了廣闊的研究平臺，然而酪氨酸激酶抑制劑療效維持時間短，獲得性耐藥不盡人意。但其共有的喹唑啉骨架藥效活性片段已在抗癌藥物的研發中不斷被成功應用。喹唑啉酮是喹唑啉的一類衍生物，也是多種生物堿和藥物的骨架。現有抗腫瘤活性的藥物多為4-喹唑啉酮結構[1-2]，如具有4(3H)-喹唑啉酮結構片段的抗葉酸劑雷替曲塞、含有三唑并喹唑啉酮結構片段的酪氨酸磷酸酶SHP2抑制劑[3-4]，但存在耐藥及毒性等缺點。

組合化學產生于20世紀80年代，其主要特點是在較短時間內得到大量具有分子多樣性的化合物，能夠與高通量篩選相結合，加快新藥研發的過程，在先導化合物的發現及結構優化中發揮重要作用。近年來，Lam 等[5-7]改善一珠一化合物法創立了一珠二化合物(one-bead two-compound，OBTC)法，OBTC 法作為高通量合成的主體，將更為簡便、準確和高效地尋找作用細胞表面的功能分子[8-9]。本研究采用OBTC 組合化學法，以氨基樹脂為固相載體，四功能分子骨架N-Alloc-3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸為模板，依據生物電子等排和骨架躍遷原理，保留喹唑啉N2位與表皮生長因子受體Gln767 羰基的潛在氫鍵作用，主要改變N3為酮基，考察經水分子橋聯與Thr766形成氫鍵的作用；同時考慮到活性位點內部的大疏水口袋可容納多樣性的基團，進一步于喹唑啉酮母核R1 處連接不同基團側鏈以考察其對活性的影響，合成具有分子多樣性的喹唑啉酮化學庫；以特異性α3β1 整合素配體LXY30—生物素—親和素的復合物形式捕獲細胞、偶聯抗胱天蛋白酶3 單抗作為探針，運用免疫細胞化學法對肺癌細胞株H1975 進行高通量篩選，以期找到具有抗肺癌活性的小分子多靶點新型2-喹唑啉酮化合物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：WRS-1B 數字熔點儀(上海申光儀器儀表有限公司)；Magna 750 型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet 公司)；Waters 2996 高壓液相色譜儀(美國Waters公司)；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(美國Billerica公司)；ABI 494蛋白測序儀(美國PerkinElmer 公司)；Avance NEO 600 核磁共振儀(德國Bruker 公司)。試劑：TentaGel S-NH2樹脂、Rink AMIDE-MBHA 樹脂、Fmoc-保護氨基酸均購自上海吉爾生化公司；LXY30為美國加州大學戴維斯生物化學和分子醫藥系贈送；其他試劑均屬分析純，購自Sigma公司；人肺癌H1975細胞株購自美國ATCC公司。

1.2 四功能分子骨架N-Alloc-3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸的合成

2-氟苯甲醛(3.00 g，2.4 mmol)、丙二酸(2.75 g，26 mmol)與醋酸銨(4.10 g，53 mmol)混合于25 mL乙醇溶液中，加熱回流過夜。反應液冷卻至室溫，收集析出的白色固體，乙醇(3×50 mL)洗滌3次，乙醚(2×50 mL)洗滌2 次，干燥。將白色固體緩慢加入冰浴的硝酸/硫酸混合物(V硝酸∶V硫酸=1∶1)中，攪拌反應6 h，將黃色反應液傾倒入40 mL的冰水中，用NaOH 調至pH=6，反應液放置室溫，減壓過濾收集白色固體3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸，水(25 mL)、乙醇(3×50 mL)和乙醚(50 mL)依次洗滌，干燥。將含烯丙氧羰酰琥珀酰亞胺(Alloc-OSu)(0.87 g，4.4 mmol/L)的N, N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide，DMF)溶液逐滴緩慢加入3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸(1.00 g，4.4 mmol)的碳酸氫鈉(0.92 g，11 mmol)水溶液中，室溫攪拌過夜，乙酸乙酯(2×40 mL)洗滌2次，用HCl 調至pH=3，減壓過濾收集白色固體，水(5×50 mL)洗滌并干燥得到四功能分子骨架NAlloc-3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸[10]。見圖1。

圖1 四功能分子骨架N-Alloc-3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸的合成路線

1.3 OBTC喹唑啉酮類化學庫的建立

TentaGel S NH2樹脂珠(6.00 g，1.86 mmol)置于水中浸泡24 h 后，過濾除去水；芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺(Fmoc-OSu)(62.74 mg，0.186 mmol)和Alloc-OSu(37.01 mg，0.186 mmol)依次溶解于二氯甲烷/乙醚(300 mL，V二氯甲烷∶V乙醚= 55∶45)混合溶液中，加入N, N-二異丙基乙胺(DIEA)(259.2 μL，1.488 mmol)溶液室溫反應45 min；過濾，依次用DMF(5×300 mL)、甲醇(3×300 mL)、DMF(3×300 mL)洗滌；分別于樹脂珠中加入含(Boc)2O(2.03g，9.30 mmol)、DIEA(3.24 mL，18.6 mmol)的DMF 溶液45 mL，室溫反應1 h；茚三酮檢測跟蹤反應，確保游離氨基反應完全；得到三功能雙層樹脂珠2。

三功能雙層樹脂珠2 中加入20%4-甲基哌啶的DMF 溶液(45 mL)進行芴甲氧羰基Fmoc 保護基的脫除后，加入含D-生物素(227.2 mg，0.93 mmol)，N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三氮唑)六氟磷酸脲(352.7 mg，0.93 mmol)及DIEA(324.0 μL，1.86 mmol)的DMF 溶液中，反應至茚三酮檢測為陰性；加入含四(三苯基膦)鈀(86.05 mg，0.074 mmol)及苯硅烷(459.0 μL，3.72 mmol)的二氯甲烷溶液(45 mL)進行脫除烯丙氧羰基Alloc保護基的脫除，得到樹脂珠3。

分離等量的樹脂珠3，分別依次加入10 個不同的Fmoc保護的氨基酸進行縮合反應，直至茚三酮反應呈陰性，得樹脂珠4。合并樹脂珠4、并加入含四功能分子骨架N-Alloc-3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸(290.6 mg，0.93 mmol)、6-Cl-HOBt(160.5 mg，0.94 mmol)及N,N′-二異丙基碳二酰亞胺(146.8 μL，0.94 mmol)的DMF 溶液，茚三酮反應監測游離氨基反應完全，過濾、洗滌，得樹脂珠5。

分離等量的樹脂珠5，分別加入8個不同的伯胺進行氟原子的取代反應，DIEA(162 μL，0.93 mmol)，反應1 h，四氯苯醌反應監測二級胺反應是否完全；合并、過濾、洗滌，得到樹脂珠6，脫去Alloc 保護基、過濾、洗滌；加入N,N′-羰基二咪唑(120 mg，0.744 mmol)、吡啶(89.25 μL，1.116 mmol)的二氯甲烷溶液，室溫反應進行環合，過濾、洗滌，得到樹脂珠7；在2 mol/L 二水合氯化亞錫的DMF溶液中進行硝基還原氨基的反應，室溫反應48 h；過濾、洗滌，得到樹脂珠8。

分離等量的樹脂珠8，分別加入10 個不同的羧酸化合物進行縮合反應，茚三酮反應監測游離氨基反應是否完全；合并、過濾、洗滌，得到樹脂珠9；采用三氟乙酸Cocktail 裂解液進行目標化合物的側鏈保護基及化合物的脫除：82.5%三氟乙酸、5%苯酚、5%苯硫基甲烷、5%水、2.5% TIS裂解2 h；5%DIEA/DMF(2×12 mL)中和，依次使用DMF(3×12 mL)、甲醇(3×12 mL)、二氯甲烷(3×12 mL)、DMF(3×12 mL)，50%DMF/水(3×12 mL)、水(3×12 mL)、70%乙醇(3×12 mL)洗滌，4 ℃儲存備用。見圖2。

圖2 一珠二化合物喹唑啉酮類化學庫的合成路線

1.4 免疫細胞化學法篩選喹唑啉酮類化合庫

LXY30-生物素與鏈霉素親和素的混合物(nLXY30-生物素∶n鏈霉素親和素=1∶2)加入含喹唑啉酮類化合庫樹脂珠的12 孔板中(1.0×105/mL)，37 ℃孵育20 min；磷酸緩沖鹽溶液洗滌，加入肺癌細胞H1975，37 ℃孵育20 min；洗滌除去未結合的細胞，孵育24 h；洗滌、4%多聚甲醛固定細胞20 min、5%牛血清白蛋白封閉非特異性蛋白、0.5%Triton X-100使細胞透膜；兔抗人胱天蛋白酶3作為一抗與樹脂珠孵育(V兔抗人胱天蛋白酶3∶V樹脂珠=1∶100)，4 ℃過夜；磷酸緩沖鹽溶液洗滌后，辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG 抗體作為二抗，室溫孵育1 h；辣根過氧化物酶活性采用二氨基聯苯胺四鹽酸鹽作為底物檢測，樹脂珠上黏附紅棕色細胞者為陽性樹脂珠，并置于顯微鏡下分離。陽性樹脂珠依次用6 mol/L鹽酸胍(pH 1.0)、水洗滌，除去樹脂珠上殘留細胞碎片或蛋白等生物大分子；利用ABI蛋白測序儀進行結構測定[4]。

1.5 碘化丙啶染色法檢測陽性樹脂珠CA10 的抑癌活性

LXY30-生物素與鏈霉素親和素的混合物(nLXY30–生物素∶n鏈霉素親和素=1∶2)加入含喹唑啉酮類小分子化合物的樹脂珠的12 孔板中(1.0×105/mL)，OBTC 喹唑啉酮類化合庫為正常組，陽性樹脂珠CA10為實驗組；37 ℃孵育20 min；磷酸緩沖鹽溶液洗滌，加入肺癌細胞H1975，37 ℃孵育20 min；洗滌除去未結合的細胞，孵育48 h；加入碘化丙啶(1 μg/mL)室溫孵育10 min，熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 結構鑒定

3-氨基-3-(2-氟苯基)丙酸：白色固體；產率：58.6%；熔點：211.5～212.1 ℃；紅外光譜：1512,1326 cm?1；質譜：m/z 184(M+1)；氫核磁共振 波 譜(600 MHz, D2O)：δ 7.40 (m, 2H), 7.20 (m,1H), 7.15 (m, 1H), 4.93 (t, 1H), 3.10 (m, 2H)。3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸：黃色固體；產率：60.6%；熔點：219.0～219.3 ℃；紅外光譜：1519, 1354 cm-1；質譜：m/z 229(M+1)；氫核磁共振 波 譜(600 MHz, D2O)：δ 8.33 (m, 1H), 8.24 (m,1H), 7.33 (t, 1H), 5.00 (t, 1H), 3.11 (m, 2H)。NAlloc-3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸：白色固體；產率：63.7%；熔點：141.9～142.3 ℃；紅外光譜：1531,1346 cm-1；質譜：m/z 313 (M+1)；氫核磁共振波譜(600 MHz, DMSO-d6) δ 12.46 (s, 1H),8.37 (m, 1H), 8.22 (m, 1H), 8.14 (d, 1H), 7.50 (t,1H),5.88 (m, 1H), 5.27 (m, 2H), 5.16 (d, 1H), 4.45 (m,2H),2.73(m,2H)。

2.2 喹唑啉酮類化學庫的高通量活性篩選

合成的OBTC化合庫中，1個樹脂珠即隨機的1 個喹唑啉酮化合物，該化合庫包含800 個化合物，其X1為不同氨基酸構成，X2為不同伯胺基團取代，X3為不同羧酸縮合。見圖3A。顯微鏡下可見待檢測肺癌細胞貼壁于樹脂珠周圍，附著紅棕色凋亡細胞的為陽性樹脂珠(如圖3B 箭頭所指)，目標化合物可以通過細胞信號級聯通路作用于細胞，引發其凋亡且作為OBTC 化合庫高通量篩選的陽性樹脂珠。

圖3 H1975肺癌細胞高通量篩選喹唑啉酮類化合庫及陽性化合物結構

2.3 碘化丙啶染色法檢測陽性樹脂珠CA10 的抑癌活性

OBTC喹唑啉酮類化合庫作為正常組，樹脂珠上附著細胞未見染色，即肺癌細胞H1975 的活性不受樹脂珠上合成化合物的影響；陽性樹脂珠CA10則清晰可見碘化丙啶染色呈紅色，即附著細胞受CA10作用而死亡。見圖4。

3 討論

一類新藥的研發一直以來呈現“三高一長”的顯著特點，即“高投入”“高風險”“高回報”和“周期長”。藥物發現處于新藥開發的源頭，是整個新藥開發的最關鍵部分。組合化學主要特點是在較短時間內得到大量具有分子多樣性的化合物，并且能夠與高通量篩選相結合，大大加快了現代新藥發現的過程，在先導化合物的發現及結構優化中發揮重要作用。

圖4 碘化丙啶染色法檢測陽性樹脂珠CA10的抑癌活性

為探討OBTC 化合庫作用于細胞的特異性信號通路，全細胞結合高通量篩選選用免疫細胞化學法優于免疫熒光法，只需在可見光下分離染色的樹脂珠即可在普通顯微鏡下操作，加快了高通量的篩選速度；同時避免樹脂珠在低溫保存、檢查過程中熒光信號的減弱。無論在細胞內源性或外源性的凋亡通路中，胱天蛋白酶3 均被激活，本研究中則采用辣根過氧化酶標記的胱天蛋白酶3抗體作為探針來篩選喹唑啉酮化合庫中的促凋亡小分子化合物。LXY30作為捕獲肺癌細胞的配體，可高選擇性結合癌細胞表面整合素亞型α3β1(IC50=0.08 μmol/L)，因此喹唑啉酮類OBTC 化合庫通過配體—生物素—鏈霉素親和素復合物的形式使被檢測的肺癌細胞靠近樹脂珠[11-12]；LXY30直接作用于檢測細胞，使其貼壁于樹脂珠周圍，1個樹脂珠即隨機的1 個喹唑啉酮化合物，喹唑啉酮類化合物可以通過細胞信號級聯通路作用于細胞，引發其凋亡從而作為OBTC 陽性樹脂珠被篩選出來。本研究經高通量篩選得到陽性化合物CA10，CA10表現較好的抑制肺癌細胞活性。

含有氮雜環的喹唑啉衍生物結構具有廣泛的生物活性，如抗菌、抗炎、抗腫瘤及抗病毒等[13-14]，特別是4-喹唑啉酮結構，而其同分異構體2-喹唑啉酮的研究較少。本研究中2-喹唑啉酮類化合庫的多樣性是通過四功能骨架分子分別引入不同取代基來完成，各個反應物因立體效應、電性效應等反應活性不一，則目的化合物收率不同，初篩結果可能存在假陽性。因此，本研究依據OBTC 法重新合成陽性化合物，免疫組化法再驗證目標化合物對肺癌細胞的促凋亡作用或不可缺；但全細胞高通量篩選因為方法選擇及測定指標有限，目標化合物的抗腫瘤活性優劣程度及分子生物學作用機制仍需要體內外細胞及整體模型的再驗證，特別是重要的肝毒性評價指標，將在后續工作中進一步探討。

OBTC組合化學庫結合高通量篩選的方法在新藥研制過程中逐漸顯示出其高效、經濟、可行的優勢特點[15-16]，盡管OBTC 化合庫仍需考慮樹脂珠內層解序標簽的合成，但一次合成、一次分析的模式避免了后期漫長瑣碎的若干化合物合成、分析的傳統模式，為諸多新藥研發的科研工作者優先考慮。

綜上所述，本研究通過OBTC 組合化學庫結合高通量篩選的方法獲得抑制肺癌細胞活性較好的化合物CA10，可作為先導化合進行進一步結構優化。