高效液相色譜法測(cè)定德拉昔布咀嚼片的體外溶出度

郭桂芳，于泓瀟，李思鴻，張藝馨，程 平，張秀英*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

德拉昔布屬于昔布類非甾體抗炎藥物(Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs，NSAIDs)，化學(xué)名為4-[5-(3-氟-4-甲氧基苯基)-3-二氟甲基-1H-咪唑-1-基]苯磺酰胺，臨床上用于治療犬骨性關(guān)節(jié)炎及其引起的疼痛，并可預(yù)防犬牙科與骨科手術(shù)后的疼痛[1]。德拉昔布原研單位為諾華制藥有限公司(Novartis Pharmaceuticals Corporation)，商品名為Deramaxx?，于2002年被美國(guó)食品與藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)上市[2]。因良好的鎮(zhèn)痛抗炎效果以及顯著降低的胃腸道副作用，德拉昔布已成為美國(guó)獸醫(yī)臨床犬骨性關(guān)節(jié)炎治療的一線藥物[3]。

德拉昔布咀嚼片(Deracoxib chewable tablets)目前尚未在我國(guó)上市銷售，對(duì)其溶出度與穩(wěn)定性的檢測(cè)也未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立考察德拉昔布咀嚼片溶出度的方法-高效液相色譜法(HPLC)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)室研制的德拉昔布咀嚼片和美國(guó)Novartis公司生產(chǎn)的Deramaxx咀嚼片進(jìn)行溶出度考察，以期為德拉昔布咀嚼片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 德拉昔布咀嚼片(實(shí)驗(yàn)室自制，規(guī)格：12 mg、25 mg，批號(hào)：20180507、20180514，20180521)；德拉昔布標(biāo)準(zhǔn)品(北京Absin公司，CAS號(hào)：169590-41-4，純度 99%)；Deramaxx(美國(guó)Novartis公司，購(gòu)自美國(guó)，規(guī)格：12 mg、25 mg，批號(hào)：175227C)；乙腈(色譜純，美國(guó)Sigma公司)。

1.2 儀器 Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó) Waters公司)；Waters 2998 紫外檢測(cè)器(美國(guó) Waters公司)；THP-10壓片機(jī)(天祺制藥機(jī)械有限公司)；RC-8D智能溶出度測(cè)定儀(北京凱德興茂有限公司)。

1.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱為Waters XSelect H88 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(pH4.5)-乙腈 (52∶48，V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)252 nm；流速1 mL/min；柱溫30 ℃。

1.4 德拉昔布咀嚼片制片工藝 采用直接壓片法[4]，按表1中處方稱取適量原輔料過(guò)60目篩，適當(dāng)調(diào)整主藥與淀粉比例，壓片，制成每片含德拉昔布12 mg/25 mg。

表1 德拉昔布咀嚼片處方

1.5 溶出度測(cè)定 溶出介質(zhì)為0.8%十二烷基硫酸鈉溶液，溶出方法為槳法，轉(zhuǎn)速50 r/min。取德拉昔布咀嚼片與Deramaxx各6片，投入裝有900 mL 0.8%十二烷基硫酸鈉溶液的溶出杯中，攪拌槳轉(zhuǎn)速為50 r/min，溶出杯內(nèi)溫度設(shè)定為37 ℃。分別在5、10、15、20、30、40和50 min取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)充同體積的溶出介質(zhì)。

1.6 溶液配制

1.6.1 對(duì)照品溶液配制 精密稱取25 mg德拉昔布標(biāo)準(zhǔn)品，以適量0.8%十二烷基硫酸鈉溶解，至250 mL容量瓶中定容，制成濃度為0.1 mg/mL德拉昔布溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.6.2 供試品溶液配制 從溶出度測(cè)定儀中取得的樣品溶液，經(jīng)3000 r/min離心5 min，取上清，0.22 μm濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

1.7 方法學(xué)考察

1.7.1 專屬性 取德拉昔布咀嚼片，Deramaxx與空白輔料分別充分粉碎，以0.8%十二烷基硫酸鈉溶液溶解，按方法1.6.2制成供試品溶液，取10 μL注入HPLC記錄色譜圖與峰面積。

1.7.2 線性關(guān)系 取不同體積1.6.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，以0.8%十二烷基硫酸鈉于10 mL容量瓶中定容，配成濃度為5、10、15、20和25 μg/mL的系列德拉昔布標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取10 μL注入液相色譜儀，應(yīng)用SPSS 22.0建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.7.3 精密度 取1.6.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液2 mL定容到10 mL容量瓶中，配成含量為20 μg/mL的德拉昔布溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖與峰面積。

1.7.4 靈敏度 取1.6.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，以0.8%十二烷基硫酸鈉溶液逐步稀釋進(jìn)行檢測(cè)，主峰響應(yīng)值為噪音水平的3倍左右時(shí)，確定檢測(cè)限，主峰響應(yīng)值為噪音水平的10倍左右時(shí)，確定定量限。

1.7.5 溶液穩(wěn)定性 取1.6.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，分別在0、2、4、8、16和24 h測(cè)定，評(píng)價(jià)德拉昔布在0.8%十二烷基硫酸鈉溶液中的穩(wěn)定性。

1.7.6 回收率 采用加樣回收率測(cè)定法，稱取適量德拉昔布空白輔料9份，分別精密添加20 mg (80%)、25 mg (100%)、30 mg (120%)的德拉昔布標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度3份平行，按方法1.6.2制成添加回收樣品溶液，測(cè)定回收率。

1.8 溶出度差異比較 分別取德拉昔布咀嚼片、Deramaxx各6片， 按方法1.5進(jìn)行溶出度測(cè)定，記錄溶出度結(jié)果并繪制溶出度與時(shí)間曲線，考察不同規(guī)格德拉昔布咀嚼片溶出度的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性 結(jié)果如圖1-圖3所示，德拉昔布保留時(shí)間約為11.3 min，主峰附近無(wú)雜峰干擾，表明方法的專屬性良好。

圖1 空白輔料溶液色譜圖

圖2 德拉昔布咀嚼片溶出度色譜圖

圖3 Deramaxx溶出度色譜圖

2.2 方法學(xué)考察 經(jīng)SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)得到樣品濃度C與峰面積A的回歸方程A=31237C+9.6559(r2=0.9992)，說(shuō)明在5～25 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，德拉昔布的濃度與峰面積呈良好的線性響應(yīng)。德拉昔布的檢測(cè)限與定量限分別為0.81 μg/mL與2.57 μg/mL；精密度測(cè)定結(jié)果為98.66%±0.73%，表明儀器精密度良好；方法的平均回收率為101.8%±0.91%；99.09%±0.68%的溶液穩(wěn)定性表明德拉昔布24 h以內(nèi)在0.8%十二烷基硫酸鈉溶劑中穩(wěn)定。表2結(jié)果表明，HPLC法檢測(cè)德拉昔布溶出度的方法可行。

表2 HPLC法檢測(cè)德拉昔布咀嚼片溶出度方法學(xué)考察結(jié)果

圖4 德拉昔布咀嚼片與Deramaxx溶出度結(jié)果

2.3 溶出度測(cè)定 結(jié)果見(jiàn)圖4。在30 min內(nèi)，德拉昔布咀嚼片溶出度87.78%±1.91%，Deramaxx溶出度88.76%±2.05%，均大于85%，符合片劑的有關(guān)規(guī)定。

2.4 溶出度差異 結(jié)果見(jiàn)圖5。25 mg/12 mg德拉昔布咀嚼片與Deramaxx在30 min的溶出度差異RSD分別為1.91%、1.84%、1.99%、1.52%，表明標(biāo)示量為25 mg和12 mg的德拉昔布咀嚼片與Deramaxx在30 min的溶出度無(wú)顯著差異。

A、B、C、D分別為同一批次25 mg德拉昔布咀嚼片、25 mg Deramaxx、12 mg德拉昔布咀嚼片、12 mg Deramaxx的溶出度圖，其中1、2、3、4、5、6分別代表1～6號(hào)樣品

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)方法的確定 一般檢測(cè)藥物溶出度的傳統(tǒng)方法為紫外法，其優(yōu)點(diǎn)是方便、快速、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣[5]，缺點(diǎn)是準(zhǔn)確度不高。由于片劑中輔料使用較為復(fù)雜，可能存在干擾紫外吸收的輔料，造成最終的檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，因此本文建立了檢測(cè)德拉昔布溶出度的HPLC法， 具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可有效分離輔料與主藥，大大提高了藥物溶出度檢測(cè)的準(zhǔn)確程度。

3.2 溶出方法的確定 片劑、膠囊、丸劑的溶出度方法都選擇為槳法。德拉昔布咀嚼片屬于片劑，因此選擇槳法進(jìn)行試驗(yàn)，轉(zhuǎn)速設(shè)定為50 r/min(槳法一般默認(rèn)轉(zhuǎn)速)，溶出溫度為模擬體內(nèi)環(huán)境選擇為37 ℃[7-9]。

3.3 溶出介質(zhì)的確定 對(duì)于難溶性藥物一般可以在溶出介質(zhì)中添加適量的增溶劑(通常為表面活性劑)以增加藥物的溶出程度。德拉昔布屬于難容性藥物，參考德拉昔布的同類藥物——維他昔布的溶出方法[6]，選擇0.8%十二烷基硫酸鈉為溶出介質(zhì)，此外溶出介質(zhì)體積通過(guò)參考謝沐風(fēng)的研究[10]，確定為900 mL。

采用本文建立的HPLC法測(cè)定了德拉昔布咀嚼片的溶出度，自制的德拉昔布咀嚼片與美國(guó)Deramaxx?在30 min內(nèi)的溶出度均大于85%，符合咀嚼片的相關(guān)規(guī)定，而且不同規(guī)格的德拉昔布咀嚼片與Deramaxx?溶出度無(wú)明顯差異，說(shuō)明本文所建立的HPLC法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于德拉昔布咀嚼片溶出度的檢測(cè)。