穿心蓮內酯納米混懸劑制備與評價

劉錦妮，郝素旗，陳嘯欽，葉兆偉，吳海港*

(1.信陽農林學院牧醫工程學院，河南信陽 464000；2.信陽市獸藥新制劑研發與創制工程技術研究中心，河南信陽 464000)

穿心蓮內酯是來源于天然植物穿心蓮的二萜類內酯化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、解熱及保護心腦血管等多種藥理活性[1-3]。然而由于穿心蓮內酯在水中溶解度低、溶出速率慢，口服時體內生物利用度差、在體內不穩定等問題，成為限制其應用的主要瓶頸[4-6]。因此，解決穿心蓮內酯在水中難溶和難溶出的問題，增加藥物吸收，改善其口服生物利用度成為眾多學者的研究熱點[7-9]。納米混懸劑是一種以表面活性劑作為助懸劑，將藥物顆粒分散在水中，通過粉碎或控制析晶技術形成的穩定的納米膠態分散體系[10]。納米混懸劑作為一種新劑型，具有高載藥量、制備工藝簡單、可實現工業化大生產等優點，被廣泛應用于難溶性藥物制劑的制備，改善藥物溶出度和生物利用度。本試驗采用反溶劑法為制備技術，以藥物穩定性為指標，通過對處方及制備工藝參數的篩選和優化，探究穿心蓮內酯納米混懸劑的最優制備工藝，為穿心蓮內酯新型制劑研發提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 泊洛沙姆188(F68)、吐溫-80、十二烷基硫酸鈉、二甲基亞砜均購于上海國藥集團化學試劑有限公司；穿心蓮內酯原料藥(含量≥93%，批號：170421)購于河南自然康生物技術有限公司。

1.2 主要儀器 SCILOGEX磁力攪拌器，上海珂淮儀器有限公司；BT-9300ST激光粒度分布儀，廈門利特晶檢測科技有限公司；JEM2100透射電鏡，合肥吉納新材科技有限公司。

1.3 穿心蓮內酯納米混懸劑制備工藝的單因素試驗

1.3.1 穩定劑濃度 穿心蓮內酯濃度為40 mg/mL、攪拌時間為1 h、攪拌速率為1000 r/min、反溶劑和溶劑的體積比為10，F68的濃度為0.05%，考察吐溫-80濃度為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%對ANDRO-NS穩定性的影響。

1.3.2 穿心蓮內酯原料藥的濃度 F68濃度為0.05%、吐溫-80濃度為1%，攪拌時間為1 h、攪拌速率為1000 r/min、反溶劑和溶劑體積比為10，考察藥物濃度分別為20、30、40、50 mg/mL對ANDRO-NS穩定性的影響。

1.3.3 反溶劑和溶劑體積比 F68濃度為0.05%、吐溫-80濃度為1%，攪拌時間為1 h、攪拌速率為1000 r/min、穿心蓮內酯濃度為40 mg/mL，考察反溶劑和溶劑體積比分別為10、15、18、20時對ANDRO-NS穩定性的影響。

1.3.4 攪拌時間 F68濃度為0.05%、吐溫-80濃度為1%，攪拌速率為1000 r/min、反溶劑和溶劑體積比為10、穿心蓮內酯濃度為40 mg/mL，考察攪拌時間分別為60、80、100、120 min對ANDRO-NS穩定性的影響。

1.3.5 攪拌速率的篩選 F68濃度為0.05%、吐溫-80濃度為1%，攪拌時間為1 h、反溶劑和溶劑體積比為10、穿心蓮內酯濃度為40 mg/mL，考察攪拌速率分別為900、1100、1200、1400 r/min對ANDRO-NS穩定性的影響。

1.4 正交試驗優化 根據單因素試驗的考察，以ANDRO-NS得率為評價指標，選取藥物濃度濃度(A)、攪拌速率(B)、攪拌時間(C)、反溶劑和溶劑體積比(D)為考察指標，采用四因素三水平L9(34)正交試驗設計(表1)。

表1 ANDRO-NS正交試驗因素水平

1.5 穿心蓮內酯納米混懸劑制備驗證試驗 稱取F68 0.0125 g、吐溫-80 0.5 mL于50 mL蒸餾水中，攪拌充分溶解，為反溶劑；稱取穿心蓮內酯原料藥0.24 g，溶于2.5 mL二甲基亞砜中，攪拌均勻溶解，為溶劑相；在攪拌速率為1400 r/min條件下將溶劑相逐漸滴加到反溶劑相中，攪拌80 min，用0.8 μm微孔濾膜過濾，即得ANDRO-NS，采用BT-9300ST激光粒度分布儀和JEM2100透射電鏡對所制備的混懸劑的粒徑和結構進行評價。

1.6 穿心蓮內酯納米混懸劑得率計算 取試驗所制備的穿心蓮內酯混懸劑，震蕩2 min，0.8 μm微孔濾膜過濾后，取下濾膜，干燥，稱量，計算穿心蓮內酯納米混懸劑的得率，其計算公式為：得率=(穿心蓮內酯納米藥物量/穿心蓮內酯藥物總量)×100%。

1.7 數據處理與統計分析 試驗數據采用Excel 2007整理并進行分析。

2 結果與分析

2.1 穩定劑種類的選擇 試驗分別考察了吐溫-80、F68、十二烷基硫酸鈉對穿心蓮內酯納米混懸劑穩定性的影響。結果表明穿心蓮內酯原料顆粒較大，呈團塊狀(圖1)；單獨一種穩定劑時，藥物結晶變為長條狀或者更小的棱形狀，但形狀大小分布極其不規則(圖2)，而使用F68和吐溫-80作為混合穩定劑時，光鏡下觀察藥物形狀大小均一，分布均勻(圖3)，因此本試驗確定F68混和吐溫-80為穩定劑。

圖1 穿心蓮內酯原料藥結構(×100)

圖2 F68對ANDRO-NS影響(×100)

圖3 混合穩定劑對ANDRO-NS影響(×100)

2.2 穩定劑濃度試驗結果 由表2分析可知，當吐溫-80濃度從0.6%升高到1.0%時，納米藥物得率增加到71.97%，當其濃度為1.2%時，得率下降。因此選用吐溫-80的濃度為1%。

表2 穩定劑濃度對穿心蓮內酯納米混懸劑的影響

2.3 藥物濃度試驗結果 由表3可知藥物濃度為40 mg/mL時得率最高，隨著藥物濃度增加，藥物顆粒碰撞的機會增加，易發生團聚。因此本試驗選用的藥物濃度為40 mg/mL。

表3 藥物濃度對穿心蓮內酯納米混懸劑的影響

2.4 反溶劑和溶劑體積比的篩選結果 根據表4可知，隨著反溶劑比例增加，納米藥物得率總體呈上升趨勢，反溶劑和溶劑的體積比為20時，觀察到的結晶外觀均為較小的球形顆粒且分布均勻，因此選擇反溶劑和溶劑的體積比為20有利于穿心蓮內酯納米混懸劑的制備。

表4 反溶劑和溶劑體積比對穿心蓮內酯納米混懸劑的影響

2.5 攪拌時間的篩選結果 由表5分析可知，攪拌時間為60 min時，藥物得率達到最高為76.62%，隨著時間的增加，得率呈現先下降后升高的趨勢，可能原因是混懸液中的微小顆粒不太穩定，出現了聚集，但攪拌時間繼續延長，又會將體系中團聚的顆粒分開。

2.6 攪拌速率的篩選結果 由表6分析可知，轉速為1200 r/min以下時得率平穩，當增加轉速時，得率也呈現增高趨勢。

表6 攪拌速率對穿心蓮內酯納米混懸劑的影響

2.7 正交試驗結果 由表7正交試驗結果分析可知，以穿心蓮內酯納米粒得率為指標時，根據極差大小，其對影響因素為C>A>B>D，依據K值大小，其較優條件為C2A2B1D1。結合單因素試驗，最終確定反溶劑法制備穿心蓮內酯納米混懸劑的最佳工藝為：攪拌速率為1400 r/min、攪拌時間為80 min、藥物濃度為40 mg/mL、反溶劑和溶劑的體積比為20。

表7 正交試驗結果

2.8 驗證試驗結果 按照上述正交試驗所確定的較優試驗條件制備穿心蓮內酯納米混懸劑的粒徑大小見圖4，其平均粒徑為568.51±13.74 nm，得率為93.71%±1.84%。取適量穿心蓮內酯納米混懸劑滴于銅網上，2%磷鎢酸負染3 min，透射電鏡觀察見圖5。

圖4 ANDRO-NS粒徑圖

圖5 ANDRO-NS透射電鏡圖(×6000)

3 討論與結論

納米混懸劑是熱力學不穩定體系，藥物的粒徑越小，其穩定性相對也越差，容易出現沉降、聚集等現象，因此在制備過程中常需加入穩定劑以解決其物理穩定的問題。表面活性劑的種類和濃度對納米混懸劑穩定性有顯著的影響，能夠與納米藥物快速形成穩定粒子，降低粒子聚集和聚結的機率[11]。本試驗前期預實驗中單用泊洛沙姆時，所制得的混懸液極其不穩定，放置24 h結晶就開始聚集變大，分析其中原因，可能是在形成ANDRO-NS時，上述單一穩定劑不足以提供足夠的立體位阻和靜電排斥作用，致使析出的納米聚集增大，引起沉淀。據文獻報道，F68和吐溫-80屬于低粘度表面活性劑[12]，可以增加混懸液穩定性，因此本試驗選擇混合穩定劑制備納米混懸劑。本試驗考察了不同的吐溫-80濃度對結晶的影響，當其為1%時，結晶外觀比較均一，當繼續增加穩定劑濃度，則納米粒穩定性降低，其原因可能是由于穩定劑濃度增大，多余的穩定劑會自組裝形成膠束，引起膠束與納米粒表面競爭來吸附穩定劑所致。因此選用吐溫-80及F68混合穩定劑進行后續研究。

反沉淀法制備的納米結晶的外觀及粒徑受到制備工藝多種因素的影響，例如藥物濃度、溶劑和反溶劑的體積比及攪拌速度等，因此需要優化制備工藝。藥物濃度是影響納米混懸劑穩定性的重要條件之一，藥物濃度過高，在反溶劑制備過程中過飽和程度更高，粒子成核迅速，生長快，但容易導致納米粒出現聚集現象，而藥物濃度過低往往達不到用藥需求，所以在制備過程中要選擇適宜的藥物濃度，從而得到理想的納米粒子并且滿足用藥量[13]。本試驗選擇藥物濃度40 mg/mL時得率最高，且粒徑穩定。

攪拌速率、時間也是影響納米混懸液穩定性重要條件之一。攪拌速率低，攪拌時間短，反應不均勻，因而獲得的結晶較大、分布不均勻。攪拌速率升高，表面活性劑可以與藥物均勻混合，有利于獲得更小的結晶。李旺[14]采用反溶劑法聯合高壓均質法制得牡荊干納米混懸劑，結果表明攪拌速率越高微粒趨向于更小，在1500 r/min時微粒最小，再增加速率，得率變化不明顯，這與本試驗結果相似。此外，本試驗對攪拌時間也進行了考察，結果顯示攪拌時間短，微粒的大小和形狀分布極其不均勻，可能是在攪拌短時間內微粒的成核速率迅速增加，微粒的生長速率低，體系中的小顆粒增加，但隨著時間的延長，得率有高有低，因此攪拌時間可以根據其他因素的高低來選擇合適的時間。本試驗結果表明在攪拌時間為80 min時，所制備的納米混懸劑的得率和外觀都較好，所以本試驗最佳攪拌時間選為80 min。

本研究通過單因素試驗和正交試驗對穿心蓮內酯納米混懸劑的處方工藝進行了優化。結果顯示，最優處方工藝條件為: 以1%吐溫-80和0.05%泊洛沙姆為穩定劑，藥物濃度為40 mg/mL，反溶劑和溶劑的體積比為20，攪拌速率為1400 r/min，攪拌時間為80 min，所制得的穿心蓮內酯納米混懸液粒徑為568.51±13.74 nm。