郁金散對大腸濕熱證大鼠HPA軸的影響機制

董嘉琪，姚萬玲，文艷巧，張旺東，張亞輝，魏彥明

(甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070)

大腸濕熱證為獸醫臨床常見病證之一，主要由濕邪與熱邪共同侵犯腸道以及病原微生物感染所致，以腹痛，泄瀉，糞便黏膩色黃，體溫升高，口渴喜飲，脈滑數，舌苔黃膩等為主要癥狀[1]。常見于現代醫學中的急慢性腸炎、細菌性痢疾、阿米巴腸炎、潰瘍性結腸炎、急性闌尾炎等疾病[2]和一些病毒感染性腸道疾病。隨著畜禽養殖業的不斷發展，與大腸濕熱證相關的疾病日漸上升，給畜牧業經濟效益帶來嚴重損失。

大腸濕熱證的發生會導致畜禽機體出現應激，破壞動物機體的動態平衡。下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸是應激反應的神經內分泌網絡之一，也是最重要的環節(圖1)。生理情況下，HPA軸的負反饋調節處于動態平衡狀態。當機體受到強烈刺激時，HPA軸的動態平衡被擾亂，就會引起多種疾病的發生，如脾胃濕熱證[3]、糖尿病[4]和中樞神經系統疾病如自閉癥、抑郁癥、帕金森和阿爾海默癥等的發生均與HPA軸功能失調關系密切[5]。CRH(Corticotropin Releasing Hormone, CRH)是上游重要的神經激素和調節因子之一，被證明在HPA軸負反饋調節中起核心作用[6]。當機體遇到應激刺激時，會作用于神經系統的不同部位，最后將信息匯集于下丘腦CRH神經元，然后通過CRH引起垂體-腎上腺皮質系統反應。其最主要表現為HPA軸的強烈興奮，PVN(Paraventricular nucleus, PVN)會大量分泌CRH，從而引起ACTH(Adrenocorticotropic hormone，ACTH)和GC(Glucocorticoid，GC)分泌增多，最終導致其負反饋調節紊亂[7]。因此，過量的CRH形成會導致HPA軸功能亢進，同時影響下游激素的分泌[8]。在HPA軸中，CRHR1(Corticotropin-releasing factor receptor 1)和CRHR2(Corticotropin-releasing factor receptor 2)已經被證明可以與CRH結合并控制其表達量[9]。并且CRHR1可能直接參與HPA軸中腎上腺CORT(CROT, Corticosterone)釋放的調節[10]。此外，GR和CBG在HPA軸反饋調節中也起著重要作用[11-12]。因此，及時有效地控制CRH的產生或相關受體的表達，對大腸濕熱證引起的HPA軸功能亢進具有調控作用。

郁金散是中(獸)醫治療胃腸濕熱病證的經典方劑之一，由大黃、郁金、黃連、黃柏、黃芩、白芍、梔子和訶子組成，臨床實踐表明，郁金散對大腸濕熱證具有較好的治療效果。而關于郁金散對大腸濕熱證機體HPA軸調控的研究尚未見報道。本研究通過分子對接和網絡分析，建立了郁金散治療大腸濕熱證的網絡藥理學研究，該研究基于郁金散的活性成分和5個潛在靶點，包括CRH、CRHR1、CRHR2、CBG和GR，并通過建立大腸濕熱證大鼠模型，用郁金散來治療以進行生物學驗證，以揭示郁金散對大腸濕熱證大鼠HPA軸調控的作用機制，為研發治療大腸濕熱證中獸藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物與菌種 7周齡清潔級Wistar大鼠60只，體重180～220 g，雌雄各半，購于蘭州大學醫學院實驗動物中心，生產許可證號為：SCXK(甘)2013-0002。產毒性大腸桿菌O101，菌號CVCC231，由中國獸藥監察所提供。

1.2 藥物與主要試劑 大黃、郁金、黃芩、黃連、梔子、黃柏、白芍和訶子，購自甘肅西域陽光大藥房，經甘肅農業大學中獸醫學教研室鑒定。郁金散根據課題組前期實驗建立的方法制備[13]。用HPLC法測定了郁金散中主要有效成分。

營養瓊脂，批號20140807，青島高科園海博生物技術有限公司；甲醛、無水乙醇、二甲苯，購于津致遠化學試劑有限公司；蘇木精、伊紅，購于北京化工廠；促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、皮質酮(CORT)ELSA試劑盒，購于北京奇松生物技術有限公司。試劑均為國產分析純，實驗用水均為純水。

1.3 主要儀器 DZ5-WS 多管架自動平衡離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；iMark型酶標儀，美國BIO-RAD公司；KD-BM組織包埋機，上海艾牧生物科技有限公司；RM2245切片機，德國Leica公司；Olympus DP-71顯微照相系統，日本Olympus公司。

1.4 靶標蛋白和配體結構的準備 從Protein Data Bank 數據庫(http: ∥www. resb. org)中檢索所有候選受體的晶體結構，包括CBG、CRH、CRHR1、CRHR2和GR作為HPA軸功能亢進的潛在靶點。從PubChem(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載郁金散相關活性成份的SDF格式的化學結構文件，保存為SDF格式，然后在ChemBio3D 模塊用MM FF94力場對這些化合物的結構進行優化。然后將受體的三維結構導入PyMOL(https:∥pymol.en.softonic.com/download)中，刪除靶蛋白分子結構中的水分子，并清除蛋白結構中相關配體。

1.5 分子對接與網絡模型構建 將處理過的受體和郁金散活性成分分別導入AutoDock 4.2(http:∥mgltools.scripps.edu/downloads)進行半柔性對接模擬計算。對接時，用Autogrid程序自動生成打分用的格點文件(受體的格點盒子的大小以包括復合物中配體為標準)，運用拉馬克遺傳算法(LGA)，得到結合自由能，并將其與對接結果進行評價。然后根據分子對接計算結果，采用 cytoscape 3.6.1 軟件構建郁金散調節HPA軸功能亢進的“有效成分-靶點”網絡模型，通過將藥物有效成分和靶點相連，繪制成一個宏觀的互作網絡，較為直觀地確定藥物有效成分作用的靶點。根據分子對接計算結果，把分子與受體導入Cytoscape 3.6.1網絡分析軟件，構建郁金散活性成分與靶點作用網絡，預測郁金散的活性成分、潛在靶點等。

1.6 動物分組及造模 將60只Wistar大鼠隨機分為正常對照組、模型組、自愈組和郁金散高、中、低劑量組，每組10只。正常對照組：自然環境下飼養，自由飲水并給予充足的普通飼料。按照實驗室已建立的方法進行大腸濕熱證模型復制[13-15]，郁金散各劑量治療組和自愈組：自由飲用蜂蜜水和灌服豬油，共10 d；然后灌服白酒，置于高溫高濕倉中，共5 d；再連續2天腹腔注射產毒性的大腸桿菌溶液，然后在自然環境中飼養一天；正常對照組灌服和腹腔內注射等量的生理鹽水。造模結束后，模型組大鼠處死取樣，正常對照組和自愈組給予生理鹽水；其余三組分別給予等量不同濃度的郁金散進行治療，連續灌服5 d，第6天處死剩余大鼠取樣。

1.7 血清中CRH、ACTH、CORT檢測 用酶聯免疫(ELISA)法按試劑盒說明檢測血清中CRH、ACTH、CORT的含量。

1.8 腎上腺指數測定 取出腎上腺，浸入生理鹽水中洗凈附著血液，用濾紙吸干表面的水分，迅速稱重。其重量與體重量之比計算腎上腺指數(mg·g-1)。

1.9 腎上腺組織病理切片制作與觀察 將腎上腺置于4%中性甲醛溶液中固定，流水沖洗24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色，然后用中性樹膠封片。采用OlympusDP-71顯微鏡進行觀察并拍照。

1.10 統計學分析 采用SPSS 23.0統計軟件對所有實驗數據進行單因素方差分析(ANOVA)，并以平均數±標準差(Mean±SD)表示，P<0.05被認為有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 郁金散活性成分測定 用HPLC法測定了郁金散中7種主要有效成分沒食子酸、鹽酸小檗堿、芍藥苷、黃芩苷、梔子苷、姜黃素和大黃素的含量，分別為1.624、2.541、2.783、21.633、17.349、0.149和0.104 mg·g-1。

圖2 郁金散活性成分化學結構式；A：黃芩苷；B：鹽酸小檗堿；C：姜黃素；D：大黃素；E：沒食子酸；F：梔子苷；G：芍藥苷

2.2 分子對接與“藥效分子-靶標”網絡構建分析從對接數據和網絡分析上看，郁金散中既存在一個分子與多個靶點相互作用，同時也存在不同分子作用于同一個靶點的現象，顯示了郁金散的多成分多靶點作用特點。GR和CRH與郁金散活性成分對接實驗的結合自由能較其他幾種受體和配體對接的數據小，說明GR和CRH與郁金散活性成分受體結合能力較強，其他結合作用相對較弱；其中GR與大黃素的結合自由能最低，說明GR與大黃素結合能力最強。并且CRH與黃芩苷、鹽酸小檗堿、姜黃素等5種成分存在相互作用。CBG、CRHR1和CRHR2與鹽酸小檗堿有較強的相互作用；CRH、CRHR2和GR等與沒食子酸、大黃素有較強的相互作用，所以可以推測CRH可能是調控HPA軸亢進的潛在靶點，鹽酸小檗堿、沒食子酸、大黃素可能是郁金散調節HPA軸亢進的活性成分。此外，梔子苷和芍藥苷與這幾種受體均無形成有效對接，故其對HPA軸的調控作用可能較弱或無作用。

表1 郁金散活性成分與HPA軸相關受體對接數據

2.4 CRH及下游激素的驗證分析

2.4.1 腎上腺指數測定 如圖所示，與正常對照組相比，模型組大鼠腎上腺指數極顯著性升高(P<0.01)，自愈組大鼠腎上腺指數顯著性升高(P<0.05)。郁金散各劑量治療組與自愈組相比，高劑量組中腎上腺指數顯著性降低(P<0.05)，中、低劑量組中腎上腺指數有降低趨勢(P>0.05)。結果表明：大腸濕熱證模型組大鼠腎上腺指數明顯升高，各劑量郁金散均能降低大鼠的腎上腺指數，且高劑量組效果最好。

2.4.2 血清中CRH、ACTH、CORT含量的變化 如圖所示，與正常對照組相比，模型組和自愈組中CRH、ACTH、CORT含量極顯著性升高(P<0.01)。郁金散各劑量治療組與自愈組相比，高、中劑量組中CRH、ACTH含量均極顯著降低(P<0.01)，低劑量組中CRH、ACTH含量也顯著性降低(P<0.05)；而高劑量組中CORT含量均極顯著降低(P<0.01)，中劑量組中CORT含量也顯著降低(P<0.05)。結果表明：大腸濕熱證模型大鼠血清中CRH、ACTH、CORT的含量明顯升高，各劑量郁金散均能降低模型大鼠血清中三者含量，且高劑量組效果最好。

圖3 郁金散活性成分與HPA軸相關受體對接結果的三維示意圖

圖4 郁金散活性有效成分與靶點相互作用的網絡

注：“*”表示差異顯著(P<0.05)；“**”表示差異極顯著(P<0.01)，以下同此。

圖6 郁金散對大腸濕熱證大鼠血清中CRH、ACTH和CORT的影響(Mean±SD，n=10，pg·mL-1)

2.4.3 腎上腺組織病理學觀察 腎上腺組織病理學觀察結果顯示，正常對照組球狀帶細胞為卵圓形或柱狀，核為球形，染色深，含1～2個核仁，核/質比例大，胞質中含一些散在的嗜堿性物質。束狀帶細胞較球狀帶細胞大，呈多邊形，可見有雙核，核圓形，胞質可呈嗜酸性，也含有嗜堿性物質，胞質內可見較豐富脂滴。網狀帶細胞排列成不規則的吻合索，索間竇清晰。網狀帶細胞有明細胞和暗細胞之分。明細胞較大，核也大，染色淡。暗細胞較小，胞質和胞核著色均較深。與對照組相比，模型組球狀帶中毛細血管擴張，含有較多紅細胞，球狀帶細胞自身變化不明顯；束狀帶細胞脂滴含量有所增多。網狀帶細胞出現較大面積的空泡化，并且網狀隙內的血竇中紅細胞較多，顯示存在瘀血現象；經高劑量郁金散治療后，各項指標均顯示有所恢復(圖7)。

圖7 腎上腺組織切片觀察(HE染色)

3 討論與結論

成分-靶標的網絡分析表明，郁金散中有效成分沒食子酸、小檗堿和大黃素等能有效改善HPA軸亢進，并且CRH作為HPA軸上游激素在整個網絡中處于重要地位，直接影響下游激素的分泌。通過動物實驗對CRH及其下游激素進行驗證結果表明，大腸濕熱證模型組和自愈組血清中CRH、ACTH、CORT的含量及腎上腺指數均顯著性升高，張鑫、武凱歌等[16-17]等研究表明脾胃濕熱證大鼠血漿中CRH、ACTH，血清中的COR含量及腎上腺指數顯著升高，朱星[3]等研究表明脾胃濕熱證大鼠血漿中CRH、ACTH的含量顯著升高；這些研究結果均與本研究結果相符。腎上腺組織病理學結果顯示，與正常對照組相比，模型組束狀帶和網狀帶結構不清，細胞排列不規則，細胞質呈空泡狀，脂滴增多，經郁金散治療后，均有所恢復。腎上腺皮質中束狀帶分泌糖皮質激素，腎上腺皮質束狀帶細胞損傷會導致糖皮質激素分泌的減少，進而使下丘腦和垂體前葉對CRH和ACTH的分泌增加，致使HPA軸功能亢進。CRH在應激反應中發揮重要作用，并通過促腎上腺皮質激素釋放激素受體(CRH-Rs)功能的改變引起一系列的生理和病理變化[18]，主要是促進垂體前葉分泌和合成ACTH，CRH的分泌增多導致血清中ACTH升高[19]；ACTH是維持腎上腺正常形態和功能的重要激素[20]，一旦腎上腺功能活動增強，便會出現質量增加及組織肥大，導致腎上腺指數升高。

現代藥理學研究表明：沒食子酸作為一種有機酸，是郁金散成分中含量最高的。它可以降低不可預知的慢性輕度應激引起的皮質酮CORT含量升高，改善慢性應激引起的HPA軸紊亂[21]。小檗堿作為黃連和黃柏的主要有效成分，對2型糖尿病大鼠引起的HPA軸功能亢進功能具有調節作用，主要表現在CORT和ACTH含量降低[22]。也有證據證明，小檗堿可以減少皮質酮誘導的抑郁模型小鼠血清中CORT的表達[23]。姜黃素作為方中郁金的主要成分，它可以顯著降低慢性應激模型大鼠血清中糖皮質激素的水平，恢復海馬對HPA軸的抑制作用[24]。黃芩苷作為黃芩中主要的活性黃酮成分，據報道，它在HPA軸功能異常導致的抑郁癥中起著重要作用，黃芩苷可以減輕嗅球切除(OBX)抑郁或皮質酮誘導的抑郁模型大鼠血清皮質酮水平，改善HPA軸功能障礙[25,26]。近期的一項研究發現，黃芩苷主要通過參與GR信號通路來減少慢性皮質酮引起的GR磷酸化，使下丘腦GR核易位正常化，恢復HPA軸正常功能，減輕小鼠異常行為[27]。而大黃素作為大黃的主要成分，亦是郁金散方中含量最少的，參與了HPA軸的神經內分泌調節[28]。也有證據表明，梔子苷和芍藥苷可以改善由于HPA軸亢進造成CORT、CRH含量升高和腎上腺指數增[29,30]，但構建的網絡中沒有顯示這種相互作用，可能梔子苷和芍藥苷是通過間接方式來調節HPA軸功能亢進，其機理需要進一步研究。研究表明傳統中獸藥復方郁金散能夠較好地調節大腸濕熱證大鼠HPA軸功能，降低CRH、ACTH、CORT的表達，抑制大腸濕熱證模型大鼠腎上腺肥大而抗應激。此外，郁金散中一些其他未被發現和測定的成分，也有可能起到調節HPA軸失衡的功效。

分子對接與網絡分析推測CRH可能是調控HPA軸亢進的潛在蛋白，鹽酸小檗堿、沒食子酸、大黃素可能是郁金散調節HPA軸亢進的活性成分。大腸濕熱證可引起機體HPA軸功能亢進，主要表現為血清中CRH、ACTH及CORT的含量升高，腎上腺指數增加，以及腎上腺皮質球狀帶、束狀帶和網狀帶細胞的損傷。經郁金散治療后，指標得到恢復。說明傳統中藥復方郁金散對大腸濕熱證模型大鼠HPA軸的動態平衡具有較好的調節作用，為研究大腸濕熱證的發病機制及郁金散對大腸濕熱證的治療機制提供了依據。