阿魏酸對青貯主要有害微生物作用效果及機理研究

張微微， 馬 瑩， 袁 媛， 孫 星， 張 汆

（滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州239000）

青貯飼料技術隨著現代畜牧業的快速發展已得到了廣泛的普及（盤道興等，2018）。 青貯飼料品質直接受青貯中微生物的生長情況調控，其中腐敗微生物會造成青貯飼料的腐敗變質和經濟損失，從而限制了青貯飼料的廣泛應用（汪文忠，2017）。 梭菌、酵母菌、霉菌及意外引入的致病微生物是青貯飼料中主要的有害微生物群落， 不僅影響青貯品質，還會對動物的健康造成威脅（張秀麗和劉召乾，2020；倪奎奎，2016）。因此，為了進一步提高青貯飼料的質量，對抑制有害微生物生長的有效舉措進行不斷地探究。 多年來，通常直接向青貯飼料中添加抑菌劑，例如化學試劑、糖類、酶制劑等（王玉榮等，2017）。 而研究發現，酚類化合物，例如阿魏酸等具有抗菌、抑菌作用（張適等，2017）。

阿魏酸（Ferulic acid），在植物中普遍存在，其pH 相對穩定，具有提高免疫力、抗菌消炎等效用，可被吸收也可被排出，幾乎無毒害性，在體內也不會積累，可作為一種較佳的綠色飼料添加劑，在飼料中的應用前景十分廣闊（宋凱等，2017）。海拉希等（2017）研究指出，阿魏酸可抑制大腸桿菌等致病菌及11 種引起食品腐敗微生物的生長，且阿魏提取物在濃度為0.6%時對于青霉和黑曲霉的抑制效果比較顯著， 抑菌效果也隨著抑菌濃度的增加和觀察時間的延長而越發顯著。 阿魏酸可以抑制瘤胃中細菌、原蟲、真菌的生長（Soberson 等，2012；Lou 等，2012；Akin，1982），但日糧中添加游離阿魏酸對奶牛的生產指標沒有影響（Aguiar 等，2014；Sobern 等，2012）。 呂珍等（2012）研究認為，阿魏酸可以通過使細胞膜結構遭到破壞來抑制其生長而達到抑菌作用，或者細菌N-乙酰轉移酶被阿魏酸抑制， 從而影響其合成而達到抗菌效果。宋凱等（2017）研究指出，阿魏酸能抑制與細菌和病毒生存相關酶的活性。

基于以上研究， 本試驗旨在研究阿魏酸對青貯中主要微生物的作用效果， 通過研究阿魏酸對酵母菌、丁梭菌、乙酸菌、霉菌的抑菌活性，檢測處理前后微生物生長性能及菌體細胞形態等的變化，闡述抑菌效果，以此為阿魏酸作為天然安全的青貯抑菌劑奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株 酵母菌、丁梭菌、乙酸菌、霉菌分離自玉米秸稈青貯， 保存于滁州學院生物與食品工程學院微生物實驗室。

1.2 材料與試劑 考馬斯亮藍G-250，南京杜萊生物有限公司；阿魏酸標準品，北京寰宇科創生物科技發展有限公司；甲醇，廣州市信洪貿易有限公司；玉米秸稈青貯，實驗室自制。

阿魏酸標準液： 用電子天平稱取0.6 g 阿魏酸標準品溶于100 mL 的甲醇溶液， 儲存于棕色容量瓶中。

1.3 主要儀器設備 分析天平（BSA124S）、生化培養箱（SPS-150B-Z）、水浴恒溫振蕩器（SHAB）、 高壓滅菌鍋（YXQ-LS-75SII）、 低速離心機（TG16-WS）、紫外分光光度計（UV745N）、電導率儀（DDB-303A）。

1.4 試驗方法

1.4.1 抑菌效果測定 濾紙片抑菌試驗： 制備0.6%的阿魏酸溶液，滴加100 μL 至每片濾紙片，取0.1 mL 菌液于平板上，涂布均勻，放入三片加了阿魏酸的濾紙片， 中間放入加甲醇的濾紙片為對照，靜置5 min，放入對應培養箱培養后用游標卡尺測定抑菌圈直徑（楊麗等，2018）。

1.4.2 抑菌曲線測定 依據史崇麗和繆錦來（2018）生長曲線法測定阿魏酸對指示菌株生長的影響。 所有處理組定點采樣， 以時間為橫坐標，OD600值為縱坐標繪制抑菌曲線。

1.4.3 阿魏酸剩余含量的測定 采用比色法，以60%的甲醇作空白，在阿魏酸特定吸收峰320 nm下測定吸光度值， 依照標準曲線計算出阿魏酸含量（蘇秀蘭和楊倚鱗，2016）。

阿 魏 酸 含 量/（μg/g）=（吸 光 度 值-0.0103）/0.0755×體積（50 mL）/樣品質量（g）；

阿魏酸標準工作方程為Y=0.0755X+0.0103。

1.4.4 微生物胞外蛋白的測定 依據聶昌宏等（2019）方法將阿魏酸處理的菌懸液與對照組置于培養箱進行培養，定時采樣，取1 mL 待測樣，加入5 mL 考馬斯亮藍顯色劑，靜置10 min，于595 nm波長處測定吸光度。

1.4.5 相對電導率測定 將阿魏酸處理的菌懸液與對照組于對應菌株培養箱進行培養， 定時（0、12、24 h）采樣，測定培養液的電導率（Karthikeyan等，2016）。

2 結果與分析

2.1 抑菌圈大小 濾紙片法可以直觀地揭示阿魏酸對于指示菌株有無抑菌效應， 其抑菌效果見表1。 0.6%的阿魏酸對四種指示菌株均具有抑菌活性，效果較為明顯。 對酵母菌、丁梭菌、乙酸菌、霉菌的抑菌圈直徑分別為10.41、9.12、8.66、

10.34 mm。 在濃度為0.6%的阿魏酸標準液處理下，酵母菌和霉菌的抑菌圈直徑較大，抑制效果顯著優于其他兩種指示菌株。

表1 抑菌圈直徑 mm

2.2 阿魏酸對指示菌株的抑菌曲線 生長曲線可以反映微生物的生長與時間的關系。 用生長曲線法測出的抑菌曲線可以通過直觀的比較揭示指示菌株的生長規律與阿魏酸的抑菌能力情況。 菌株的抑菌曲線如圖2。 經阿魏酸處理的各指示菌株生長趨勢均弱于對照組， 研究結果與Soberon等（2012）報道一致。酵母菌生長總體呈增長趨勢，但阿魏酸處理組總趨勢均弱于對照組； 丁梭菌0 ～2 h 處于適應期， 速度增長緩慢，2 h 之后慢慢進入對數期，增長速度加快，但阿魏酸處理組緩慢增長并于22 h 進入穩定期； 乙酸菌0 ～5 h 為停滯期，培養8 h 后，對照組9 h 達到頂峰，之后進入穩定期，而阿魏酸處理組一直處于抑制狀態，無增長；霉菌由于培養周期長，0 ～24 h 處于緩慢增長狀態，而阿魏酸處理組趨勢明顯弱于對照組。由此可推斷，阿魏酸能抑制指示菌株的生長，使其未能形成對數高峰期。

圖2 抑菌曲線

2.3 阿魏酸剩余含量的測定 菌株對阿魏酸的利用能力見圖3，在酵母菌、丁梭菌、乙梭菌、霉菌生長過程中， 阿魏酸持續被消耗， 作用于指示菌株，抑制其生長。

圖3 阿魏酸剩余含量

2.4 阿魏酸對胞外蛋白含量的影響 利用考馬斯亮藍G-250 在酸性條件下和蛋白質結合的原理， 進行可溶性蛋白含量的測定。 試驗結果如圖4。 各指示菌株胞外蛋白含量總體呈增長趨勢，在含有阿魏酸的試驗組， 胞外蛋白的含量在試驗期間內均低于對照組，結果與呂珍等（2013）相同。阿魏酸處理后，由于菌體處于不利環境，為了抵御環境正常生長， 菌體處于脅迫狀態下會將合成蛋白用于修復損傷部位，提高生存率，加之此時阿魏酸可能與相關酶進行結合會影響相關蛋白的產生，使其不能及時修復相關損傷部位， 隨之細胞膜的完整性不斷遭到破壞，菌體大量裂解死亡，導致胞外蛋白含量低于對照組。經阿魏酸處理后，酵母菌試驗組胞外蛋白含量降低了16.4%， 丁梭菌試驗組胞外蛋白含量降低了6%， 乙酸菌試驗組胞外蛋白含量降低了8.2%，霉菌試驗組胞外蛋白含量降低了10.8%。 相比細菌類阿魏酸對于真菌類的抑制效果更為明顯。

圖4 胞外蛋白的變化

2.5 相對電導率 液體培養基中的電導率一般隨著培養的進行而降低， 培養液體系的電導主要由液體中電解質影響（Katrhikeyan 等，2016；Trang等，2009），結果如表2。 指示菌株的生長狀況與培養液電導率的變化趨勢相反， 隨著培養時間的延長，電導率隨之下降，試驗組相較于對照組均有降低， 說明阿魏酸影響了指示菌株對培養基的利用能力， 對各指示菌株均具有抑制作用。 樊新民等（2006）與雒江菡等（2020）研究表明，菌株的生長情況與培養液的電導率呈負相關， 隨著試驗的進行，電導率不同程度的下降，從而證明了本試驗結果的可信。 在0 時刻電導率不一致的原因可能是不同菌株初始時刻對于阿魏酸的耐受能力有所不同。 培養過程中，阿魏酸作用使得丁梭菌和乙酸菌兩種細菌菌體的細胞膜通透性改變，內有細胞內容物流出，改變了培養基的電導率，但是隨著培養時間的延長，沒有死掉的菌體生長消耗了培養液中的無機鹽類，電導率繼而又會有不同程度的降低，而且細菌細胞壁的結構改變和細胞膜的通透性程度與阿魏酸濃度相關。

表2 處理組電導率的變化 us/cm

3 結論

本研究發現阿魏酸對青貯中酵母菌、丁梭菌、乙酸菌和霉菌均具有較為強烈的抑制作用。 其抑菌機理可能與延長指示菌株的適應期， 破壞蛋白質的合成，影響指示菌株對培養基的利用能力，干擾菌株生理代謝活動有關。綜上所述，阿魏酸對青貯中主要有害微生物均有抑制作用， 但阿魏酸作為青貯抑菌劑，是否影響青貯品質，還需進一步深入研究。