miR-637靶向AKT3對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞侵襲和轉移能力的影響

袁青領，樊玉霞，劉 洋，王曉明，劉 征，賈 勐，耿祖仕，鄭 建，盧秀波

鄭州大學第一附屬醫院甲狀腺外科 鄭州 450052

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常見的人類甲狀腺惡性腫瘤之一，目前全球發病率逐漸升高；PTC占所有甲狀腺惡性腫瘤的60%～80%[1]。MicroRNA(miRNA)是長約22個核苷酸的小分子非編碼單鏈RNA，可與其下游靶基因的3’非翻譯區(3’UTR)相結合，參與細胞的增殖、凋亡及分化等生物學過程[2-3]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase, AKT)在細胞生理過程的各個階段發揮重要作用，可磷酸化絲氨酸/蘇氨酸[4]。AKT3是其亞型之一，其高表達可引起細胞惡性轉化，參與甲狀腺癌的進展過程[5]。

我們使用生物信息學軟件預測miR-637與AKT3基因之間存在靶向關系并應用雙熒光素酶報告實驗進行了驗證，然后觀察轉染miR-637的PTC細胞TPC-1中AKT3蛋白表達的變化以及細胞遷移及侵襲能力的改變，以期從分子水平闡明miR-637對PTC的影響。

1 材料與方法

1.1細胞、主要試劑及儀器DMEM、胎牛血清(美國 Hyclone公司)；二甲基亞砜、Transwell試劑盒(美國Sigma公司)；TPC-1細胞株(中國科學院細胞庫)；miR-637 mimic、miR-637陰性對照(NC)購自上海吉凱基因公司；LipofectamineTM2000、質粒提取試劑盒、雙熒光素酶報告實驗試劑盒(美國Invitrogen公司)；CCK-8(碧云天公司)；兔抗人AKT3、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(Abcam公司)；熒光素酶活性檢測儀(德國Berthold公司)。

1.2miR-637與AKT3基因靶向關系的預測及驗證運用TargetScan對miR-637可能的靶基因進行預測。然后，應用雙熒光素酶報告實驗對預測結果進行驗證。由上海吉凱基因公司設計并合成AKT3的野生型(AKT3-WT)和突變型(AKT3-MUT)3’UTR雙熒光素酶報告質粒，并分別連接到pmirGLO載體上，構建成pmirGLO-AKT3-WT-3’UTR和pmirGLO-AKT3-MUT-3’UTR。按照LipofectamineTM2000操作指南操作，將pmirGLO-AKT3-WT-3’UTR或pmirGLO-AKT3-MUT-3’UTR聯合miR-637 mimic或miR-637 NC共轉染至TPC-1細胞中，24 h后檢測細胞的熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.3實驗分組TPC-1細胞接種于DMEM培養液中，于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養至對數生長期。調整細胞密度，以每孔1.0×104個/孔接種于96孔板中，分為空白對照組(不轉染)、陰性對照組(轉染miR-637 NC)及miR-637組(轉染miR-637 mimic)，每組設6個復孔。按操作手冊進行轉染，37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中轉染4～6 h，更換培養液后繼續培養48 h。

1.4Western blot法檢測細胞中AKT3蛋白的表達取3組細胞，RIPA裂解細胞并提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，變性后進行SDS-PAGE電泳分離，轉移至PVDF膜，用脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h后加入AKT3抗體(按1∶500稀釋)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(按1∶500稀釋)，室溫孵育2 h。ECL顯影，凝膠成像系統中曝光。以目的條帶與內參β-actin條帶灰度值的比值表示AKT3相對表達量。實驗重復3次。

1.5劃痕實驗檢測細胞遷移能力分組處理48 h后，用胰蛋白酶將miR-637組和空白對照組細胞消化為單細胞懸液。在6孔培養板背面每隔0.5 cm畫橫線。分別在每孔中加入5×105個細胞，過夜。將直尺垂直于培養孔背后的橫線，用移液槍槍頭沿直尺在培養板上做劃痕，PBS溶液洗滌劃下的細胞，在37 ℃、體積分數5%CO2環境中培養，0、48 h后分別取樣拍照，使用Image J軟件分析劃痕寬度變化。細胞遷移率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復3次。

1.6Transwell小室檢測細胞侵襲能力分組處理48 h后，取miR-637組和空白對照組細胞，分別加入無血清培養基孵育12 h，消化并離心，收集細胞，調整細胞密度為1×105個/mL。用基質膠包被Transwell小室，在含有體積分數5%CO2的培養箱中37 ℃孵育3 h，上室中加入細胞懸液100 μL，下室加入含體積分數30%胎牛血清的培養液500 μL繼續培養24 h，PBS液沖洗，用多聚甲醛固定并用結晶紫染色，然后于光學顯微鏡下隨機選取3個視野(×100)，計數穿膜細胞，計算均值。實驗重復3次。

1.7統計學處理使用SPSS 22.0分析和處理數據。miR-637 NC組和miR-637 mimic組熒光素酶活性的比較采用兩獨立樣本t檢驗；空白對照組、陰性對照組及miR-637組AKT3蛋白相對表達量的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗；miR-637組和空白對照組細胞遷移率及穿膜細胞數的比較采用兩獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1miR-637與AKT3靶向關系的驗證TargetScan預測結果(圖1)說明miR-637能夠識別AKT3 mRNA 3’UTR的CCCCCAG序列，并與之互補配對。雙熒光素酶報告實驗結果(表1)顯示，pmirGLO-AKT3-WT-3’UTR與miR-637 mimic共轉染的細胞螢火蟲熒光素酶活性下調，表明miR-637通過與野生型AKT3 mRNA的3’UTR結合，促進其降解，AKT3是miR-637的靶基因。

圖1 生物信息學預測miR-637和AKT3的靶向關系

表1 雙熒光素酶報告實驗結果(n=3)

2.23組細胞中AKT3蛋白表達的比較Western blot結果見圖2?？瞻讓φ战M、陰性對照組及miR-637組AKT3蛋白相對表達量分別為(0.37±0.03)、(0.48±0.06)和(0.17±0.02)；3組比較，差異有統計學意義(F=40.526，P<0.001)；與空白對照組和陰性對照組比較，miR-637組細胞AKT3蛋白相對表達量降低(P<0.05)。

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：miR-637組

2.3劃痕實驗和侵襲實驗結果見圖3、圖4和表2。與空白對照組相比，miR-637組細胞遷移率和穿膜細胞數均明顯降低。

上：miR-637組；下：空白對照組

A、C：miR-637組；B、D:空白對照組

表2 2組細胞遷移率和侵襲細胞數的比較

3 討論

PTC患者可通過放/化療或外科手術進行治療，但治療后存在生活質量降低的風險[6]，并伴有預后不良或復發[7]，這主要是因為PTC具有增殖異常、凋亡受阻、侵襲能力強及淋巴結轉移率高等特性[8-9]。因此，進一步探究PTC的發病機制，對臨床開發治療PTC的新方法至關重要。目前研究表明，已經有多種miRNA通過調節其下游靶基因的表達影響PTC的發展：miR-128通過負調控鞘氨醇激酶1抑制PTC細胞的生長[10]；miR-146b-5p通過靶向結合 CCDC6，促進PTC的發展[11]。miR-637是一個潛在的抑癌分子，且在人和小鼠中高度保守，可抑制膠質瘤、黑色素瘤細胞的增殖，同時可促進細胞凋亡[12-13]。另外，已有研究證明miR-637能夠通過調控下游靶基因的表達發揮抗肝癌[14]、抗膽管癌[15]以及抗胰腺癌[16]的作用，但在PTC 中的作用尚不清楚。我們利用生物信息學軟件分析發現miR-637與AKT3 mRNA的3’UTR 存在結合位點，提示AKT3可能是miR-637的靶基因；雙熒光素酶報告實驗證實兩者存在靶向關系。研究[17-20]表明，AKT3在多種癌癥中發揮原癌基因作用，如前列腺癌、肺癌、乳腺癌、食管癌等。miR-200a可通過抑制AKT3 mRNA的翻譯影響膠質瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力[21]。上調miR-203可通過下調AKT3表達，抑制PTC細胞的上皮-間充質轉化、侵襲、增殖和遷移，誘導PTC細胞凋亡[22]。

我們以TPC-1細胞株為研究對象，應用miR-637過表達技術，觀察其對AKT3表達的影響：Western blot檢測結果表明miR-637過表達能夠降低TPC-1細胞中AKT3蛋白的表達；劃痕實驗及Transwell實驗結果表明miR-637過表達能夠抑制TPC-1細胞的侵襲和遷移能力。綜上所述，miR-637通過靶向作用于AKT3 mRNA的3’UTR，負性調控AKT3的表達，從而抑制甲狀腺癌TPC-1細胞的侵襲和遷移能力。miR-637有望成為PTC治療的新靶點。