YAP通過激活自噬調控腦膠質瘤細胞血管生成擬態的形成

周麗麗，安吉洋

1)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院神經外科 鄭州 450052

腦膠質瘤惡性程度高，預后差，抗血管靶向治療是防止其侵襲和進展的重要策略[1]。然而研究[1]表明，抗血管生成治療藥物貝伐珠單抗不能提高膠質瘤患者的總體生存率，甚至可能因缺氧等因素加速腫瘤侵襲轉移，增強化療抵抗，并在停藥后迅速反彈。血管生成擬態(vasculogenic mimicry，VM)是腫瘤細胞的另一種供血途徑，在腫瘤發生發展中起著重要作用[2]。自噬在膠質瘤VM形成中發揮重要作用[3]。自噬通過介導血管內皮生成因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2)活化促進VM的形成[1]，LC3是自噬過程的標志物。Yes相關蛋白(yes-associated protein,YAP)是Hippo信號通路中最關鍵的下游效應因子，在包括膠質瘤在內的多種惡性腫瘤中高度表達，并參與腫瘤的發生發展[4]。本研究以膠質瘤細胞為研究對象，以YAP為靶點，通過基因干預和藥物干預方法研究YAP對膠質瘤細胞自噬及VM形成的影響，為膠質瘤的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1細胞系與主要試劑人腦膠質瘤細胞系HS683、H4、U118、U87和U251細胞購自上海中科院細胞庫。維替泊芬(YAP抑制劑)購自Selleck公司，二甲基亞砜(DMSO)、兔抗LC3抗體購自Sigma公司，兔抗YAP抗體購自Cell Signaling Technology公司，兔抗VE-cadherin抗體購自Abcam公司，二抗購自Proteintech公司。

1.2細胞培養和YAP蛋白表達的檢測HS683、H4、U118、U87和U251細胞分別用含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基和MEM培養基(Hyclone公司)，于37 ℃、體積分數5% CO2的細胞培養箱中培養。采用Western blot法檢測上述細胞中YAP蛋白的表達：RIPA裂解液提取細胞總蛋白；取50 μg蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，濕轉法轉移至PVDF膜，將膜放入50 g/L脫脂牛奶或牛血清白蛋白中37 ℃封閉1～2 h；加一抗(兔抗YAP抗體，1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜后，將膜與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h，洗膜后采用化學發光法顯影，凝膠成像系統拍照后采用Quantity One軟件測定條帶灰度值，目的蛋白的表達水平以目的蛋白條帶和GAPDH條帶灰度值的百分比表示。實驗重復3次。

1.3調控YAP表達對U87和U251細胞VM形成及LC3、VE-cadherin蛋白表達的影響根據1.2結果篩選出YAP高表達的U251細胞系和YAP低表達的U87細胞系，采用慢病毒感染干擾U251細胞系YAP的表達、上調U87細胞系YAP的表達。具體步驟如下：取對數生長期的細胞，U87細胞感染YAP過表達慢病毒(Flag標記的LV-YAP，YAP過表達組)和陰性對照慢病毒；U251細胞感染YAP shRNA慢病毒(YAP shRNA組)和陰性對照慢病毒，所用慢病毒均由中國吉凱基因有限公司合成。感染24 h后用含血清培養基培養，并用0.2 mg/L嘌呤霉素篩選細胞。

參照文獻[5]觀察膠質瘤細胞VM結構的形成：96孔板用30 μL Matrigel基質膠(美國BD公司)涂布，37 ℃下聚合1 h后，將篩選出的細胞分別以2×104個/孔的密度接種到基質膠表面，孵育24 h。倒置顯微鏡下觀察細胞形態并計數管樣結構。實驗重復3次。

收集篩選出的細胞，提取蛋白。按1.2中Western blot法檢測YAP、LC3(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)、VE-cadherin蛋白的表達，其中一抗均按1∶1 000稀釋，二抗均按1∶10 000稀釋。實驗重復3次。

1.4維替泊芬對U87和U251細胞VM形成及YAP、LC3、VE-cadherin蛋白表達的影響U251和U87細胞分別接種于96孔板和6孔板，2×105個/孔，以5 μmol/L(根據預試驗選擇)維替泊芬處理。另設溶劑對照組。處理24 h后，96孔板細胞用于在倒置顯微鏡下觀察細胞形態并計數管樣結構，6孔板細胞裂解，提取蛋白，采用Western blot法檢測YAP、LC3、VE-cadherin蛋白的表達情況。

1.5統計學處理應用SPSS 16.0處理數據。采用兩獨立樣本t檢驗比較YAP shRNA組(U251細胞)、YAP過表達組(U87細胞)與陰性對照組管樣結構數、YAP蛋白、LC3及VE-cadherin蛋白表達的差異，以及溶劑對照組和維替泊芬組上述指標的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同膠質瘤細胞系中YAP蛋白的表達YAP在不同膠質瘤細胞系中的表達不同，U87細胞中表達最低，U251細胞中表達最高(圖1)。

2.2調控YAP表達后U251及U87細胞VM形成及LC3、VE-cadherin蛋白表達的變化下調U251細胞YAP表達后，VM形成減少，LC3、VE-cadherin表達減低；上調U87細胞YAP表達后，VM形成增多，LC3、VE-cadherin表達增高(圖2、3及表1、2)。

圖1 不同膠質瘤細胞系中YAP蛋白的表達

A1、A2：陰性對照組和YAP shRNA組(U251細胞)；B1、B2：陰性對照組和YAP過表達組(U87細胞)

1、2：陰性對照組和YAP shRNA組(U251細胞)；3、4：陰性對照組和YAP過表達組(U87細胞)

表1 YAP干擾對U251細胞VM形成及YAP、LC3、VE-cadherin蛋白表達的影響

表2 YAP過表達對U87細胞VM形成及YAP、LC3、VE-cadherin蛋白表達的影響

2.3維替泊芬對U251和U87細胞VM形成及YAP、LC3、VE-cadherin蛋白表達的影響與溶劑對照組相比，維替泊芬組VM形成減少，YAP表達減低，LC3和VE-cadherin的表達也減低(圖4、5，表3、4)。

A1、A2：分別為溶劑對照組、維替泊芬組(U251細胞)；B1、B2：分別為溶劑對照組、維替泊芬組(U87細胞)

1、2：分別為溶劑對照組、維替泊芬組

表3 維替泊芬對U251細胞VM形成及YAP、LC3、VE-cadherin蛋白表達的影響

表4 維替泊芬對U87細胞VM形成及YAP、LC3、VE-cadherin蛋白表達的影響

3 討論

VM是一種腫瘤組織內微環境結構，腫瘤細胞通過變形、重塑以及相互連接形成管腔樣結構，向組織供應血液[2]。VM陽性的腫瘤一般具有高侵襲性、生長迅速、易轉移、預后差等特點[6]。自噬是指細胞處在低氧、營養及生長因子匱乏的環境時通過降解錯誤折疊的蛋白及受損細胞器以滿足能量需求、維持存活[7-11]。研究[1]發現自噬可誘導VEGFR-2激活，從而促進膠質瘤干細胞形成VM，抑制自噬可以減少貝伐珠單抗誘導的移植膠質瘤VM形成。自噬相關基因Becin1被抑制后，膠質瘤細胞VM形成減少[6]。本研究發現基因及藥物干預YAP后，VM形成和自噬相關蛋白的表達均有相同的變化趨勢，提示YAP可能通過調控自噬影響VM形成。研究[7]顯示，YAP/TAZ共轉錄調節肌球蛋白Ⅱ基因的表達和F-actin應激纖維的聚合，從而促進自噬體的形成，細胞對缺氧及低糖耐受，具有更強的增殖活性。在乳腺癌、卵巢癌中均有研究發現YAP通過誘導自噬促進腫瘤細胞存活及耐藥[8-10]。

YAP是微環境內細胞的壓力感受器，也是Hippo信號通路下游關鍵的效應因子。YAP功能異常與腫瘤的發生、細胞增殖、干性維持、侵襲轉移等密切相關。近年來的研究[11-14]發現mTOR、SOX2等多種分子通過維持YAP的功能促進膠質瘤進展。Wei等[15]在胰腺導管腺癌中發現抑制YAP-TEAD復合物后，Ang2、MMP2、VE-cadherin、α-SMA表達降低，VM形成減少。Azad等[16]研究發現，YAP/TAZ是介導VEGF/VEGFR誘導的血管生成及VM形成的關鍵分子。YAP 通過調控Twist 與F-actin 蛋白促進膠質瘤細胞的侵襲、轉移能力[17]。YAP影響了腫瘤增殖、細胞形態、黏附蛋白、EMT表型等，使腫瘤細胞具備了形成VM的表型特征；YAP 被激活后入核與HIF-1α結合形成復合物，維持HIF-1α的穩定性，并促進其表達與轉錄，進一步增強腫瘤細胞形成VM的條件[18]。

總之，本研究發現YAP影響了膠質瘤細胞VM的形成，其機制可能與調控自噬有關。本研究為揭示參與VM形成的信號通路提供了實驗依據，為膠質瘤的抗血管治療提供了新的靶點。