ZBTB20對脂多糖誘導的大鼠心肌細胞的保護作用

曹劍英,史慧婷,劉雪蒙,鄞誠光,孔令堯,張文遠,張彥周

鄭州大學第一附屬醫院心血管內科 鄭州 450052

膿毒血癥是臨床上常見的一種全身炎癥反應綜合征，心臟是膿毒血癥損傷的重要器官，心力衰竭是導致膿毒血癥患者死亡的重要原因[1]。脂多糖(LPS)被認為是炎癥反應和細胞凋亡的始動因子[2]。LPS可刺激心肌炎癥因子的產生，包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和IL-6，在膿毒血癥中導致心肌炎癥損傷[3]。此外，LPS還可通過激活或上調多種應激信號級聯反應[如促分裂原活化蛋白激酶和核轉錄因子-κB(NF-κB)]誘導心肌細胞凋亡，該機制在膿毒血癥導致的心肌損傷中起著關鍵作用[4-6]。然而，目前缺乏特異性治療膿毒血癥心肌損傷的方法。

含鋅指和BTB結構域的ZBTB20是POK轉錄抑制家族的新成員，其含有完整的N端BTB結構域和C端鋅指結構域[6]。有研究[7-9]報道，ZBTB20參與多種生物過程，如細胞增殖、轉錄調節、離子通道裝配和染色質重塑等。據報道[7]，ZBTB20通過調節上皮生長因子受體的表達促進小鼠再生肝臟中肝細胞的增殖。ZBTB20可以抑制NF-κB抑制蛋白(IκBα)基因轉錄，控制IκBα蛋白表達，促進Toll樣受體觸發的先天免疫應答[8]。還有研究[10]發現ZBTB20通過抑制叉頭框蛋白1(FoxO1)的轉錄促進了肝細胞的增殖和細胞周期進程,但其對心肌細胞的作用尚不明確。本研究觀察過表達ZBTB20對LPS誘導的原代大鼠心肌細胞活力、凋亡的影響，探討可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1原代大鼠心肌細胞的分離和培養取出生后1～3 d的SD大鼠(SPF級，購自北京華阜康生物公司)，頸椎脫臼法處死后消毒，剪開胸腔取出心臟，剪去心房和右心室，將左心室置于D-Hanks液中清洗，用剪刀剪成1～2 mm3的碎塊，置于1.25 g/L胰蛋白酶溶液(美國Thermo Fisher Scientific公司)中消化15 min×5次，收集后4次消化液于離心管內，添加含體積分數10%胎牛血清的DMEM-F12培養基(美國Thermo Fisher Scientific公司)終止消化。離心后棄上清液，重懸細胞后，均勻接種于75 mL的培養瓶中90 min(成纖維細胞貼壁，心肌細胞仍懸浮)，收集上清液中的細胞，接種于直徑10 cm培養皿中，加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷抑制成纖維細胞增殖，培養48 h后得到單層貼壁細胞。經α-actin免疫熒光鑒定為心肌細胞后用于后續實驗。

1.2過表達ZBTB20腺病毒的構建過表達ZBTB20腺病毒由山東維真公司構建，過程如下：將ZBTB20序列克隆到pShuttle-CMV(美國Qbiogene公司)中，并在細菌BJ5183中與pAdeasy-1載體系統(美國Qbiogene公司)重組。重組質粒轉染HEK293細胞，包裝成腺病毒。使用氯化銫梯度離心純化。

1.3心肌細胞分組和處理將1.1中分離的心肌細胞分為對照組(PBS處理12 h)、LPS組(以1 mg/L LPS處理12 h)和ZBTB20組[細胞感染過表達ZBTB20腺病毒(MOI=80)8 h后再用1 mg/L LPS培養12 h]。

1.4對照組和ZBTB20組細胞中ZBTB20蛋白表達的檢測采用Western blot法。收集對照組和ZBTB20組細胞，分別加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白。通過BCA法檢測蛋白濃度。取20 μg 蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜上，將膜置于50 g/L脫脂奶粉封閉液中封閉2 h，洗膜，加入ZBTB20抗體(按1∶1 000 稀釋，美國Abcam公司)4 ℃ 過夜孵育。TBST洗膜后加入二抗(按1∶3 000稀釋，美國Abcam公司)室溫孵育1 h。DAB顯色。以目的蛋白條帶與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.53組細胞活性的檢測采用MTT法。細胞接種于96孔板。按1.3分組處理后，每孔加入20 μL MTT溶液(上海碧云天生物技術有限公司)。37 ℃孵育4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量光密度(OD)值。以未處理細胞為空白對照。細胞活性=OD處理/OD空白對照×100%。實驗重復3次。

1.63組細胞炎癥因子水平的檢測采用ELISA法。細胞接種于6孔板，培養24 h后分組處理。處理完畢后分別加入100 μL RIPA裂解液置于冰上裂解15 min，收集細胞，按照ELISA試劑盒(美國Biolegend公司)說明書步驟檢測3組細胞裂解液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。實驗重復3次。

1.73組細胞中活性氧的檢測采用2’，7’- 二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光探針進行活性氧檢測。細胞接種于24孔板，培養24 h后分組處理。處理完畢后采用PBS洗滌5 min，每孔加入100 μL含10 μL DCFH-DA探針的培養液，使細胞與 DCFH-DA 探針充分結合，37 ℃避光孵育30 min，每隔3～5 min混勻一次；隨后PBS洗滌3次以去除殘留的DCFH-DA。顯微鏡下拍照,采用酶標儀(激發波長540 nm，散發波長590 nm)定量分析熒光強度。實驗重復3次。

1.83組細胞凋亡檢測采用TUNEL染色試劑盒(美國Millipore公司)進行凋亡檢測。細胞接種于24孔板，分組處理后收集細胞，用PBS漂洗3次后用40 g/L多聚甲醛固定，采用TritonX-100通透，再用PBS清洗3 min。加入平衡液室溫下孵育10 s 后滴加TdT工作液，37 ℃孵育1 h。加入工作液振蕩15 s后孵育10 min，PBS洗3次，吸干液體，滴加抗地高辛熒光工作液，避光孵育約30 min后，PBS 再洗3次，DAPI封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。正常的細胞核可被染為藍色，而凋亡的細胞核則被染為綠色。每組選擇8 個視野(×200)，記錄凋亡細胞數，計算細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.93組細胞NF-κB核轉位水平檢測采用免疫熒光染色法。細胞接種于24孔板，分組處理后以40 g/L多聚甲醛固定，隨后PBS洗滌3次，以TritonX-100通透5 min，PBS洗滌3次后用80 g/L羊血清封閉1 h，加入NF-κB抗體(按1∶500稀釋，美國Cell Signaling Technology 公司)孵育過夜，第2天37 ℃復溫后，PBS洗滌5次，隨后加羊抗兔568熒光二抗孵育1 h，PBS洗滌3次。采用DAPI進行核染色和封片，熒光顯微鏡下拍照。每組細胞計數20個視野(×200)，每個視野下計數核轉位陽性細胞(紅、藍色重合細胞)數，除以細胞核總數，取平均值，即為NF-κB核轉位率。實驗重復3次。

1.10統計學處理采用SPSS 23.0進行分析，應用兩獨立樣本t檢驗比較對照組和ZBTB20組ZBTB20蛋白表達水平的差異，應用單因素方差分析比較3組細胞活性、炎癥因子水平、活性氧水平、細胞凋亡率和NF-κB核轉位率的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1對照組和ZBTB20組ZBTB20蛋白表達的比較與對照組(0.12±0.06)相比，ZBTB20組細胞ZBTB20蛋白表達水平(0.56±0.07)增高(t=14.951，P<0.001)(圖1)。

圖1 對照組和ZBTB20組ZBTB20蛋白的表達

2.23組心肌細胞活性和炎癥因子水平的比較見表1。與對照組比較，LPS組心肌細胞活性降低，炎癥因子水平均升高；與LPS組相比，ZBTB20組以上指標均有改善(P<0.05)。

表1 3組心肌細胞活性和炎癥因子水平的比較

2.33組心肌細胞活性氧水平、細胞凋亡率和NF-κB核轉位率的比較見圖2和表2。與對照組比較，LPS組心肌細胞活性氧水平、細胞凋亡率、NF-κB核轉位率均升高；與LPS組比較，ZBTB20組以上指標均有改善(P<0.05)。

綠色：凋亡；藍色：細胞核；紅色：NF-κB(箭頭表示陽性細胞)

表2 3組心肌細胞活性氧水平、細胞凋亡率和NF-κB核轉位率的比較

3 討論

原代心肌細胞具有收縮特性和電傳導特性，且在細胞活性、生理特性上都更接近活體細胞，故本實驗選用原代心肌細胞。在制備大鼠原代心肌細胞中作者采用胰蛋白酶短時多次消化獲得的細胞，然后應用差速貼壁分離法和化學試劑抑制法分離純化，從而獲得高質量、數量多、損傷小的心肌細胞，為后續實驗奠定了良好的基礎。

膿毒血癥為宿主對感染反應失調引起的致命性器官功能障礙。LPS可誘導膿毒血癥休克多器官功能障礙，其中心肌功能障礙是公認的主要表現之一[11]。該研究結果表明，LPS處理后心肌細胞活力部分喪失，但給予ZBTB20預處理可以改善心肌細胞活力，表明ZBTB20可以有效保護心肌細胞免受LPS誘導的細胞毒性作用。

實驗[12]表明，LPS可誘導炎癥因子如TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放，進一步引起心肌細胞凋亡和心力衰竭。該研究結果顯示，LPS處理后心肌細胞TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高，細胞凋亡增多，而ZBTB20可改善上述作用，發揮心肌細胞保護作用，提示ZBTB20預處理的心肌保護作用可能與抗炎特性有關。ZBTB20減弱LPS誘導的心肌細胞炎癥反應和減少凋亡的可能機制尚不清楚。已有文獻[13-14]證明，在LPS誘導的信號級聯反應中，NF-κB基因的轉錄激活被認為是最關鍵步驟；NF-κB被激活后，IκBα磷酸化降解，導致NF-κB亞基從細胞質轉移到細胞核。此外，還有研究[2]顯示，急性炎癥和膿毒性心臟功能不全大鼠心臟組織中NF-κB活性增加，并與大鼠死亡率密切相關。因此，作者檢測了心肌細胞NF-κB的核轉位情況，發現ZBTB20預處理可減弱LPS誘導的NF-κB核轉位水平，提示ZBTB20可能通過抑制NF-κB來保護心肌細胞免受LPS刺激損傷。

綜上所述，ZBTB20可能通過降低NF-κB的核轉位水平改善LPS誘導的心肌細胞損傷。本實驗為膿毒血癥心肌損傷的治療提供了新的理論指導方向。