蘿卜硫素預處理通過TLR4/MyD88/NF-κB通路對缺氧/復氧大鼠心肌細胞的保護作用

李云鵬，楊玉丹

1)鄭州大學第一附屬醫院心血管內科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 450052

隨著冠脈介入技術及抗栓藥物的發展，缺血性心血管疾病的病死率得到了很大提高，但心肌梗死后心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷仍然難以避免，I/R損傷致心肌梗死后心室重構，導致患者生活質量下降，甚至死亡[1]。心肌I/R損傷是一系列炎癥反應、氧化應激、凋亡和自噬等機制參與的復雜的病理生理變化過程[2]。研究[3]表明，急性炎癥反應在I/R早期階段起了關鍵作用，抑制過度炎癥反應可改善受損心功能，所以，控制炎癥是一種較好的改善心肌I/R損傷的治療策略，為臨床治療心肌I/R損傷提供了方向。蘿卜硫素是由硫甙衍生而來的一種異硫氰酸鹽，大量存在于蕓苔屬植物中，具有抗氧化應激、抗炎、抗腫瘤的作用[4]。作者前期研究[5]發現蘿卜硫素能改善缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)所導致的心肌損傷，但具體作用機制尚不明確。本研究通過建立離體心肌H/R損傷模型模擬在體I/R損傷，觀察蘿卜硫素是否通過抑制炎癥來減輕心肌細胞H/R損傷及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料蘿卜硫素(美國Sigma-Aldrich公司，貨號：S6317-5 mg)，乳酸脫氫酶(LDH)ELISA試劑盒(美國Biovision公司)，炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及β-actin抗體(美國Abcam公司)。SD大鼠乳鼠購自鄭州大學實驗動物中心[合格證號SYXK(豫)2019-0002]。

1.2原代心肌細胞培養和H/R模型制作參考既往文獻[5-6]分離SD大鼠乳鼠原代心肌細胞并制作H/R模型。H/R條件：將含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基更換為不含血清的無糖DMEM培養基，用95%N2充入H/R培養箱內先排空空氣，37 ℃培養3 h后將培養基更換為含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37 ℃、體積分數20%O2、5%CO2環境培養3 h。

1.3不同濃度蘿卜硫素預處理對H/R心肌細胞形態、存活率和LDH分泌的影響大鼠原代心肌細胞分為5組。正常對照組：原代心肌細胞正常培養；H/R 組：給予缺氧3 h/復氧3 h處理；低、中、高濃度蘿卜硫素組：缺氧前1 h分別給予0.1、1.0、5.0 μmol/L蘿卜硫素預處理，然后建立H/R模型。倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

細胞存活率檢測：將原代心肌細胞接種于96孔板，每孔接種104個細胞。分組處理完成后，置于體積分數5%CO2、37 ℃培養箱繼續培養24 h，每孔加入20 μL MTS(美國Promega公司)繼續培養4 h顯色，用酶標儀檢測490 nm波長處吸光度。細胞存活率=實驗組吸光度/空白對照孔吸光度。

LDH活性檢測：收集各組細胞培養液上清，應用ELISA試劑盒檢測LDH活性，具體步驟參考試劑盒說明書。以上實驗重復3次。

1.4蘿卜硫素對H/R心肌細胞TNF-α、IL-6、IL-1β分泌和胞內TLR4、MyD88和p-NF-κB p65蛋白表達的影響另取大鼠原代心肌細胞接種于6孔板，每孔接種2×106個。分為3組，正常對照組、H/R組、蘿卜硫素組，前2組同上處理，蘿卜硫素組于缺氧前1 h給予5.0 μmol/L蘿卜硫素預處理，然后建立H/R模型。

收集各組細胞培養液上清，應用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6、IL-1β濃度，具體步驟參照試劑盒說明書。

收集各組細胞提取總蛋白，上樣、SDS-PAGE電泳、轉膜，50 g/L脫脂奶粉溶液封閉后，加TLR4抗體(按1∶500稀釋)，MyD88、p-NF-κB p65和β-actin抗體 (均按1∶10 000稀釋)，4 ℃孵育，搖床過夜；加相應二抗(按1∶8 000稀釋)，室溫孵育2 h，洗膜。ECL發光，使用凝膠圖像分析系統檢測。以目的蛋白條帶和β-actin條帶灰度值的比值為目的蛋白的表達量。以上實驗重復3次。

1.5統計學處理應用SPSS 20.0處理數據。采用單因素方差分析比較5組心肌細胞存活率和LDH分泌水平，以及3組心肌細胞TNF-α、IL-6、IL-1β分泌水平及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達水平的差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同濃度蘿卜硫素預處理對H/R心肌細胞形態、存活率及LDH分泌的影響正常對照組心肌細胞存活狀態良好，搏動有力并呈一致性；H/R組存活心肌細胞減少，細胞搏動無力，節律改變；低、中、高濃度蘿卜硫素組存活細胞較H/R組增多，細胞搏動轉好，高濃度(5.0 μmol/L)效果最好(圖1)。

與正常對照組對比，H/R組心肌細胞存活率下降，細胞損傷和活性指標LDH分泌水平升高(P<0.05)；與H/R組比較，中、高濃度蘿卜硫素均可升高心肌細胞存活率，降低LDH分泌水平，尤以高濃度(5 μmol/L)效果更好(P<0.05)，因此后續實驗選取5 μmol/L為蘿卜硫素的作用濃度。見表1。

A、B、C、D、E：分別為空白對照組，H/R組和低、中、高濃度蘿卜硫素組

表1 各組心肌細胞存活率及LDH分泌水平比較

2.2蘿卜硫素預處理對H/R心肌細胞炎癥因子分泌及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達水平的影響見表2。與正常對照組比較，H/R組炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β釋放增多；與H/R組比較，蘿卜硫素組炎癥因子的釋放減少(P<0.05)，表明蘿卜硫素對H/R造成的炎癥損傷具有改善作用。與正常對照組比較，H/R組心肌細胞TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白表達水平升高；而蘿卜硫素預處理則可以減弱上述效應(P<0.05)。

表2 各組心肌細胞炎癥因子分泌及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達水平比較

3 討論

在心肌I/R損傷初期，細胞損傷表現為炎癥反應，最終導致心室重構，發生心功能障礙[7-8]；而促炎分子機制尚未完全闡明，所以研究I/R損傷過程中炎癥的預防治療十分有意義。研究[9]表明，右旋美托咪啶預處理通過抑制HMGB1蛋白的表達而減少細胞壞死性凋亡，改善心肌細胞H/R損傷。另有學者[10]研究發現，天然的黃酮刺槐素能夠減輕心肌細胞H/R損傷，其機制是通過AMPK介導的Nrf2激活，之后參與一系列抗炎、抗氧化、抗凋亡的細胞內信號而發揮作用。

研究[4]表明蘿卜硫素具有抗炎、抗氧化等多種生物學效應。在本實驗中，我們首先設置不同濃度蘿卜硫素處理探索最佳的藥物濃度，結果顯示H/R后心肌細胞搏動變差，存活率下降，LDH活性顯著增高，提示造模成功，而給予中、高濃度蘿卜硫素處理后，心肌細胞搏動增強，存活率升高，LDH活性下降，表明蘿卜硫素可以改善H/R心肌細胞損傷，且5 μmol/L效果更好。進一步研究發現，H/R組造模后，細胞培養液上清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高，表明H/R后心肌細胞發生炎癥反應，應用蘿卜硫素處理后上述炎癥因子下降，表明炎癥受到抑制。

TLR4影響多種生理、病理過程的基因調控，在介導炎癥反應中起著重要作用[11]。MyD88是TLR信號通路中的重要分子，參與炎癥的發生發展；NF-κB p65是TLR4的下游效應因子，TLR4可通過配體與MyD88結合，引起NF-κB p65從細胞質到細胞核轉位，然后NF-κB p65與DNA結合并參與IL-1β、IL-6和TNF-α多種細胞因子的轉錄[12]。故TLR4/NF-κB p65信號通路在炎癥信號的傳遞中發揮著重要作用。有學者[13]研究發現，鷹嘴豆芽素A能夠通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路介導的炎癥途徑減輕心肌H/R損傷。在本研究中，H/R能誘導TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達增強，蘿卜硫素處理后，三者表達均下降，表明蘿卜硫素可能是通過TLR4/MyD88/NF-κB通路抑制炎癥從而減輕心肌H/R損傷，確切機制尚需要進一步探討。