細胞色素P450 2A13野生型/突變體穩定表達Flp-InTM CHO細胞系的建立

鄭丹丹，李 靖，王永林，李勇軍，劉 亭

1)貴州醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室 貴陽 550025 2)貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室 貴陽 550004 3)貴州醫科大學藥學院 貴陽 550025 4)貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心 貴陽 550004

細胞色素P450家族2亞家族A成員13(CYP2A13)是最近研究發現的比較重要的一類CYP450，其表達有組織特異性，主要在人肺部、支氣管以及鼻咽喉等呼吸道組織中表達[1-2]。研究[1-2]表明，煙草特異性致癌物4-甲基亞硝胺-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)以及黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)等環境致癌物可被CYP2A13高效代謝活化，并且CYP2A13遺傳多態性可影響人體環境毒物敏感性。

在CYP2A13已報道的單核苷酸多態性(SNP)位點中，有9個位于外顯子區域，共產生8種突變體，分別是CYP2A13*2、*3、*4、*5、*6、*7、*8和*9，其中*3、*4和*7突變體均無活性，而*2、*5、*6、*8和*9突變體具有代謝活性，并能引起NNK相關肺癌易感性的個體差異[3-4]。本文擬構建穩定表達CYP2A13*1(野生型)、*2、*5、*6、*8和*9的Flp-InTMCHO細胞系，為體外研究CYP2A13多態性對人體環境毒物敏感性的影響提供工具。

1 材料與方法

1.1主要材料pcDNA5/FRT載體、Flp-InTMCHO細胞系由浙江大學陳樞青教授免費贈送。pOG44質粒，含CYP2A13*1、*2、*5、*6、*8和*9基因片段的pGEM-T重組質粒由本實驗室保存。HindⅢ、NotⅠ、T4等工具酶均購自Invitrogen公司；Ham′s F12培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、Trizol試劑購自Gibco公司；TOP10感受態細菌、氨芐青霉素、潮霉素B、質粒提取試劑盒、ECL Plus超敏發光液、RIPA裂解液均購自索萊寶公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗CYP2A13抗體均購自Abcam公司；AFB1購自Sigma公司；MTS、FuGENE6轉染試劑購自Promega公司；熒光定量試劑盒、反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司。PCR引物由上海恒英公司合成，引物如下：GAPDH上游引物為5’-GAGTCAACG GATTTGGTCGT-3’，下游引物為5’-GACAAGCTTC CCGTTCTCAG-3’；CYP2A13上游引物為5’-CCTG GTGATGACCACCC-3’，下游引物為5’-CGTGGAT CACTGCCTCTG-3’。多功能酶標儀購自Thermo Scientific公司；凝膠成像儀購自Bio-Rad公司。

1.2pcDNA5-CYP2A13*1、*2、*5、*6、*8和*9重組質粒的構建分別將pGEM-CYP2A13*1、*2、*5、*6、*8和*9等質粒用HindⅢ和NotⅠ雙酶切，切膠回收CYP2A13片段，并用T4連接酶連接CYP2A13片段和pcDNA5/FRT的HindⅢ和NotⅠ酶切產物。用連接產物轉化TOP10感受態細菌，挑取克隆培養并抽提質粒，通過HindⅢ和NotⅠ雙酶切驗證，挑選出陽性克隆進行測序，測序正確的克隆于-80 ℃保存。

1.3pcDNA5-CYP2A13轉染CHO細胞系用含500 mg/L博來霉素的Ham′s F12完全培養基(含體積分數10%胎牛血清)在37 ℃、體積分數5% CO2的培養箱中培養Flp-InTMCHO細胞。細胞生長至約80%融合時，用胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期的細胞，胰蛋白酶消化計數，轉至6孔板中，待細胞長至70%融合，用0.3 μg pcDNA5-CYP2A13質粒及5 μg pOG44質粒與10 μL FuGENE6混合物轉染細胞。轉染24 h后用含600 mg/L潮霉素B的Ham′s F12完全培養基培養4周，篩選候選陽性克隆，并用含500 mg/L博來霉素的Ham′s F12完全培養基來驗證候選陽性克隆的博來霉素敏感性，得到陽性克隆。陽性克隆繼續以含600 mg/L潮霉素B的Ham′s F12完全培養基維持培養。用pcDNA5/FTR空載體轉染細胞作為陰性對照。

1.4CYP2A13mRNA表達水平的檢測取以上方法構建的陰性對照細胞(vehicle-CHO)和各CYP2A13-CHO細胞系進行CYP2A13 mRNA測定。利用Trizol試劑提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA。反應體系：1.0 μL cDNA，10 μmol/L上下游引物各0.8 μL，10 μL SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。以GAPDH為內參，通過2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達量。實驗重復3次。

1.5CYP2A13蛋白表達水平的檢測利用RIPA裂解液提取vehicle-CHO和各CYP2A13-CHO細胞系總蛋白，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將20 μg等量蛋白變性后進行SDS-PAGE，然后將蛋白轉印至PVDF膜，胎牛血清封閉2 h。一抗(兔抗CYP2A13多克隆抗體，稀釋度1∶100；小鼠抗β-actin單克隆抗體，稀釋度1∶5 000)4 ℃孵育過夜；洗膜后，二抗(稀釋度1∶2 000)室溫孵育2 h。用ECL Plus超敏發光試劑盒進行檢測，凝膠成像儀系統成像，使用Quantity One軟件進行灰度值分析，以目的蛋白與內參β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.6AFB1對CYP2A13-CHO的細胞毒性用培養基將細胞密度調整為1.5×105個/mL，然后轉至96孔板中，每孔加入100 μL，培養24 h。空白組用含體積分數0.1%DMSO的完全培養基處理細胞，各實驗組細胞給予AFB1(200 mg/L)處理24 h后，加入MTS溶液(100 μL Ham′s F12加入5 μL MTS)孵育2 h。使用多功能酶標儀測定490 nm處的吸光度(A)值，按下列公式計算細胞存活率：存活率=(A實驗組-A培養基/A空白組-A培養基)×100%。實驗重復3次。

1.7統計學處理用SPSS 18.0進行統計分析。不同組間CYP2A13 mRNA及蛋白相對表達量、細胞存活率的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1pcDNA5-CYP2A13質粒的鑒定瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，陽性克隆經過HindⅢ和NotⅠ酶切后，出現了一條1 500 bp左右的條帶(圖1)。將陽性克隆測序，結果與GenBank報道的CYP2A13基因(NG_007928)序列一致，說明質粒構建成功。

2.2CYP2A13-CHO細胞模型的鑒定相比vehicle-CHO組細胞，各CYP2A13-CHO組中CYP2A13 mRNA和蛋白表達水平上升，細胞存活率降低(圖2，表1)。

M：DL15000 DNA Marker；1、2：pcDNA5-CYP2A13*1及其酶切；3、4：pcDNA5-CYP2A13*2及其酶切；5、6：pcDNA5-CYP2A13*5及其酶切；7、8：pcDNA5-CYP2A13*6及其酶切；9、10：pcDNA5-CYP2A13*8及其酶切；11、12：pcDNA5-CYP2A13*9及其酶切

1～6：CYP2A13*1、*2、*5、*6、*8、*9-CHO組；7：vehicle-CHO組

表1 各組細胞CYP2A13 mRNA及蛋白相對表達量、細胞存活率的比較(n=3)

3 討論

Flp-InTMCHO細胞基因組引進了一個Flp重組酶的作用靶點(FLP recombination target，FRT)，表達載體中的目的基因通過Flp重組酶介導后，定點整合至FRT位點[5-6]。使用該細胞構建的轉基因細胞系有兩個優點：該系統可實現定點插入、蛋白表達量一致，可以保證不同突變體蛋白表達量一致，便于進行活性比較；將帶有目的基因的pcDNA5/FRT載體與pOG44載體共轉染Flp-InTMCHO宿主細胞，通過潮霉素B篩選28 d左右便可得到穩定轉染細胞系且不需單克隆篩選，耗時短，工作量少[5-6]。故本文采用Flp-InTMCHO細胞進行CYP2A13野生型和突變體穩定表達細胞的構建。

SNP主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。SNP是CYP450遺傳多態性的主要存在形式，其可產生多種突變體，且某些SNP可以改變基因表達或酶蛋白中氨基酸的組成，從而影響CYP450的合成和活力。CYP2A13可代謝激活AFB1等環境毒物，導致細胞DNA損傷進而促進細胞癌變，對CYP2A13各SNP突變體進行功能性研究，將為篩選環境致癌物易感人群提供重要的理論指導[7-8]。

在已報道[3-4]的CYP2A13的SNP中，CYP2A13*3、*4和*7均不表現出酶活性。故本實驗只建立了表達CYP2A13野生型(CYP2A13*1)/突變體(CYP2A13*2、*5、*6、*8和*9)Flp-InTMCHO細胞系。實驗表明，和轉染空載體的CHO細胞相比，轉染各個CYP2A13野生型和突變體的細胞中CYP2A13 mRNA和蛋白表達水平均增加，并且體現出較強的AFB1敏感性，說明成功構建了CYP2A13穩定表達的Flp-InTMCHO細胞系。但是CYP2A13野生型和突變體表達細胞對AFB1敏感性差異不大。AFB1可被人體吸入，在體內經過代謝活化，產生AFB1-8,9-環氧化物，表現出強毒性和致癌性[9]。以上結果表明，作為主要表達在人呼吸道中的AFB1優勢代謝酶，CYP2A13的SNP多態性可能不會導致人體對AFB1敏感性的變化[10]。

綜上所述，本研究建立了穩定表達CYP2A13野生型和各突變體的Flp-InTMCHO細胞系，目的蛋白均能均一表達并發揮活性。以上工作為研究CYP2A13介導的環境毒物敏感性差異機制提供了實驗工具。