胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠子宮切口瘢痕缺陷的修復(fù)作用

孫文靜，胡孟彩，高 翔，樊 榮

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州450052

剖宮產(chǎn)術(shù)引起的切口瘢痕缺陷嚴(yán)重影響女性生殖健康和生存質(zhì)量。剖宮產(chǎn)子宮切口瘢痕缺陷(previous cesarean scar defect，PCSD)的發(fā)生機制復(fù)雜，臨床上尚無很好的醫(yī)治方法，目前常用的方法有激素治療和手術(shù)治療，主要以改變癥狀為主，因此探索高效且能預(yù)防以及迅速修補PCSD的方法非常重要[1]。研究[2-3]證實，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(placental mesenchymal stem cell，PMSc)在特定環(huán)境下能夠誘導(dǎo)分化為子宮平滑肌細(xì)胞，且骨髓和臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞已用于子宮損傷修復(fù)的研究。本研究觀察了PMSc用于子宮切口瘢痕缺陷修復(fù)的效果，報道如下。

1 材料與方法

1.1材料雌性SPF級SD大鼠50只，7～8周齡，體重(220±20) g，雄性SD大鼠25只，9～10周齡，體重(320±20) g，清潔級別。生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2017-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22 ℃，通風(fēng)，采光條件良好；大鼠采用專用籠喂養(yǎng)，給予專用飼料、專用水。實驗中遵循國家制定的有關(guān)實驗動物保護和使用指南。該研究獲得鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。PMSc凝膠購自北京漢氏聯(lián)合生物技術(shù)有限公司，批號 CXSL1800117。

1.2大鼠PCSD制模方法通過預(yù)實驗并參考文獻[4]，在子宮切口的肌壁上注射LPS(1 g/L，1 mL/kg體重)，并應(yīng)用電刀電凝切口兩側(cè)(功率為10 W)，5-0可吸收線間斷縫合子宮切口，制作PCSD模型。

1.3實驗動物的分組和處理將雌雄SD大鼠2∶1合籠，次日早晨行陰道分泌物涂片實驗，鏡下觀察到有精子者記為受孕第1天。2只未受孕，余48只孕鼠隨機分為4組，對照組、模型組、治療A組、治療B組，每組12只，均在孕第19天行剖宮取胎術(shù)。對照組：距離子宮頸分叉上方2 cm處行剖宮取胎術(shù)，縱向剪開子宮左側(cè)系膜的對側(cè)緣，取出全部鼠仔和胎盤，同法處理另一側(cè)子宮后，逐層關(guān)腹;模型組：行剖宮取胎術(shù)后，采用1.2方法制作PCSD模型;治療A組：造模后子宮切口局部均勻涂抹PMSc凝膠0.5 mL;治療B組：造模后子宮切口肌層多點注射PMSc凝膠0.5 mL。剖宮取胎術(shù)后對照組大鼠死亡1只，模型組死亡2只，治療A、B組各死1只，死亡原因為感染、出血。隨機剔除對照組1只、治療A組和治療B組各1只，最終參與實驗的大鼠為每組10只。實驗第50天，處死大鼠，留取雙側(cè)子宮標(biāo)本。每個標(biāo)本隨機收集子宮切口上、中、下3段組織各1塊混合。

1.4瘢痕區(qū)域子宮肌層α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)檢測切片常規(guī)脫蠟，置于蒸餾水中，流水沖洗1 min后用Weigert鐵蘇木素A、B液1∶1混合后，染色5～10 min，水洗，分別滴加1∶200稀釋的α-SMA一抗、TGF-β1一抗50 μL(抗體均購自博奧森生物技術(shù)有限公司)，4 ℃過夜孵育，室溫復(fù)溫1 min，PBS沖洗,顯色。復(fù)染、脫水、封片后制成永久性玻片標(biāo)本用于觀察。α-SMA、TGF-β1免疫組化染色陽性細(xì)胞為棕黃色顆粒。α-SMA陽性面積百分比：100倍鏡下隨機選取6個區(qū)域，計算機分析系統(tǒng)測得所選區(qū)域肌層α-SMA陽性面積與總面積的比值，取均值，同法獲得TGF-β1陽性面積的百分比。

1.5子宮肌層厚度、內(nèi)膜厚度及子宮內(nèi)膜缺陷的檢測取各組標(biāo)本，常規(guī)行HE染色。用Image-Pro Plus計算機圖像分析軟件進行分析，50倍鏡下評估子宮肌層的厚度；100倍鏡下測量子宮肌層與內(nèi)膜交界處至宮腔的垂直距離，即為子宮內(nèi)膜厚度。子宮內(nèi)膜缺陷：子宮內(nèi)膜厚度為0。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。4組間各指標(biāo)的比較用χ2檢驗或單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1子宮瘢痕區(qū)域HE染色結(jié)果對照組可見稀少的毛細(xì)血管，子宮肌層稍薄，分布有序，少數(shù)炎性細(xì)胞浸潤。模型組瘢痕區(qū)域未見明顯毛細(xì)血管，肌層變薄，肌纖維斷裂、消失，內(nèi)膜變薄，嚴(yán)重者上皮中斷、不連續(xù)，大量炎性細(xì)胞浸潤，甚至間質(zhì)增生、水腫，肉芽組織形成。治療A、B組情況相似，偶可見新生豐富的毛細(xì)血管，肌纖維排列整齊，肌層、內(nèi)膜厚度較模型組厚，內(nèi)膜中斷情況改善。見圖1上排。

A:對照組；B：模型組；C：治療A組；D：治療B組；1：HE染色結(jié)果；2：α-SMA蛋白；3：TGF-β1蛋白

2.2子宮瘢痕區(qū)域α-SMA、TGF-β1免疫組化染色結(jié)果對照組子宮瘢痕區(qū)域肌層內(nèi)可見大量α-SMA陽性細(xì)胞，呈條索狀、連續(xù)分布，與內(nèi)膜的邊界清楚。模型組α-SMA陽性細(xì)胞稀散分布，不連續(xù)，與內(nèi)膜層的分界模糊。與模型組相比，治療A、B組α-SMA陽性細(xì)胞明顯增多，排列有序，與內(nèi)膜層的分界清楚。4組瘢痕區(qū)域子宮肌層組織細(xì)胞漿及細(xì)胞膜中均可見TGF-β1蛋白呈棕黃色表達。見圖1中排和下排。

2.34組大鼠子宮瘢痕區(qū)域各指標(biāo)比較與對照組比較，模型組子宮瘢痕區(qū)域肌層厚度與內(nèi)膜厚度、α-SMA陽性面積百分比均降低，TGF-β1陽性面積百分比、子宮內(nèi)膜缺陷率升高；與模型組比較，治療A、B組以上指標(biāo)均有改善。見表1。

表1 4組大鼠子宮瘢痕區(qū)域各指標(biāo)的比較

3 討論

近年來，PMSc展示出巨大的應(yīng)用前景[5]。目前多項研究[6-7]表明，PMSc具有分化為平滑肌細(xì)胞的潛力。在子宮瘢痕中，膠原纖維蛋白沉積是主要問題，它能夠影響子宮天然細(xì)胞的增殖、分化和遷移。研究[8]顯示，α-SMA與TGF-β1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝、啟動纖維化過程，是關(guān)鍵的細(xì)胞因子，主要通過調(diào)控成纖維細(xì)胞的分化促進纖維連接蛋白的合成與細(xì)胞間質(zhì)的增生、抑制細(xì)胞外基質(zhì)的分解，最終導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。大鼠子宮在組織學(xué)上呈管腔狀，從外向內(nèi)依次為外膜、肌層和內(nèi)膜。透明的漿膜層為外膜，薄如紙張，與肌層粘連緊密，不容易分離；由外縱內(nèi)環(huán)構(gòu)成的兩層平滑肌為肌層，較厚，具有收縮能力，肌細(xì)胞排列有序，內(nèi)可見血管、疏松的結(jié)締組織；上皮和間質(zhì)組成內(nèi)膜，上皮是排列緊密的單層柱狀上皮，呈褶皺狀，間質(zhì)含有單管狀腺體。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組子宮瘢痕區(qū)域肌層變薄，肌纖維斷裂，甚至缺損，膠原纖維增加；內(nèi)膜層變薄，上皮缺陷嚴(yán)重；肌層厚度、內(nèi)膜厚度、α-SMA陽性面積百分比均低于對照組，子宮內(nèi)膜缺陷率高于對照組，證明模型構(gòu)建成功，與羅惠娟等[9]研究結(jié)果一致。

Buhimschi等[10]的研究表明，子宮組織損傷后，必須恢復(fù)為原來的細(xì)胞、組織結(jié)構(gòu)，方能恢復(fù)其本身的功能。本研究通過局部肌層多點注射移植和局部涂抹移植2種方式，初步探索PMSc凝膠對大鼠子宮切口瘢痕缺陷的預(yù)防和修復(fù)作用，結(jié)果顯示，與模型組相比，治療A組、治療B組肌層厚度、α-SMA陽性面積百分比均較高，可見切口部位移植的PMSc有助于子宮平滑肌細(xì)胞的生長，促進該部位原有結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，推測與PMSc向子宮平滑肌細(xì)胞的分化有關(guān)，本研究結(jié)果與陳志文等[11]、韋偉等[12]的動物實驗結(jié)果相似。治療A、B兩組之間對比，肌層厚度、α-SMA陽性面積百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。提示兩種給藥方法均可修復(fù)子宮切口瘢痕缺陷。

本研究結(jié)果還顯示，模型組TGF-β1陽性面積百分比高于對照組，表明PCSD的發(fā)生與瘢痕纖維化密切相關(guān)，局部應(yīng)用PMSc凝膠后，治療A、B組的TGF-β1陽性面積百分比低于模型組，因此推斷瘢痕區(qū)域TGF-β1表達的下降能夠逆轉(zhuǎn)瘢痕纖維化的形成，PMSc可能通過調(diào)控TGF-β1的水平，改善局部微環(huán)境，促進平滑肌細(xì)胞的再生，恢復(fù)瘢痕區(qū)域結(jié)構(gòu)和功能的完整性。該研究后期還需要更多的實驗進一步證實。本研究結(jié)果有望為臨床上有效預(yù)防PCSD的發(fā)生提供思路和方法。