黑曲霉兩步法與化學氧化聯合浸出花崗巖鈾礦石

祖媛媛，李廣悅,*，孫 靜，李芳艷，王永東

1.南華大學 鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學 極貧鈾資源綠色開發技術湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001

隨著高品位鈾礦資源的逐漸枯竭，中低品位鈾礦資源的高效開發利用已成為目前亟需解決的一項重要課題。然而，傳統的浸出方法存在成本高、環境污染大等缺點，無法高效回收這些資源。生物浸出方法因其具有成本低、能耗少、生態環境危害小、工藝流程簡單、資源利用率高等特點，而被廣泛關注。其中，氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、氧化硫硫桿菌(Acidithiobacillusthiooxidans)等細菌浸出方法已應用于工業生產[1]。

真菌浸出是一種新型的生物浸礦方法，其主要利用真菌代謝產生的有機酸與礦物中的金屬離子形成絡合物，將金屬溶解出來[2-3]。與細菌相比，真菌具有對生長環境要求低、生長速率快、生物量大等優勢。黑曲霉(Aspergillusniger,A.niger)是常用的浸礦真菌，具有適應性強、代謝活性高、有機酸產量大等特點，被眾多學者用于鈾、銅、錳等金屬的浸出研究。Amin等[4]用從礦石中分離的黑曲霉等八種真菌開展含鈾沉積巖浸鈾研究，其中黑曲霉和黃曲霉的鈾浸出率最高。Ghazala等[5]開展了黑曲霉發酵液中提取的檸檬酸浸出磷礦中鈾的研究，發現當固液比為1∶20時，鈾浸出率可達91.1%。Mehta等[6]用黑曲霉從印度洋錳結核中浸出銅、鎳、錳和鈷，四種金屬的浸出率分別為97%(Cu)、98%(Ni)、86%(Co)、91%(Mn)。Chaerun等[7]用黑曲霉發酵液浸出低品位鎳褐鐵礦和腐泥礦，結果表明：鎳褐鐵礦中金屬鎳的浸出率達88.9%，腐泥礦中金屬鎳的浸出率為84.9%。Vakilchap等[8]開展了黑曲霉浸出拜耳法赤泥中的有價金屬研究，鋁、鈦、鐵的浸出率分別為69.8%、60%、25.4%。Qu等[9]采用黑曲霉浸出赤泥中的重金屬，發現在高礦漿濃度條件下，一步浸出法會明顯抑制黑曲霉產生有機酸的活性，而兩步浸出法更有利于黑曲霉產酸。

花崗巖型鈾礦是我國重要的一類鈾礦資源，占已探明鈾儲量的28%左右[10]。花崗巖鈾礦中的主要鈾礦物為瀝青鈾礦，U(Ⅳ)所占比例高。黑曲霉浸鈾過程是通過黑曲霉代謝產生的有機酸的酸化和絡合作用，將固相中的鈾變為液相中可溶的絡合物。但由于U(Ⅳ)的溶解度低，因此，需將U(Ⅳ)氧化為U(Ⅵ)。

目前，對真菌浸礦方式的研究較多，主要包括以下三種[11]：(1)一步浸出法，即將真菌和礦石同時培養；(2)兩步浸出法，即先將真菌進行一段時間的預培養，再將礦石加入進行浸出；(3)發酵液浸出法，即先將真菌發酵培養，然后用其發酵液進行浸礦。但將黑曲霉兩步法與化學氧化聯合浸鈾的研究仍未見報道。為此，本工作擬通過開展搖瓶實驗，研究黑曲霉預培養時間、浸出時間和不同氧化劑及其用量對花崗巖鈾礦石浸出的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器和材料

VB-40全自動高壓蒸汽滅菌器，北京萊比信科技發展有限公司；SPH-2112F全溫度恒溫培養振動器、BPMJ-150F生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺、GZX-9140MBE數顯鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；Research移液槍，德國Eppendorf公司；AL104電子天平，精度萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司；PHS-3C精密pH計，精度百分之一，上海雷磁儀器廠；D/max 2500X射線衍射儀，日本理學公司。

實驗所用黑曲霉菌株(A.niger)由南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室分離純化，并置于-80 ℃冰箱中保藏。黑曲霉的復壯和孢子的制備采用PDA固體培養基，黑曲霉浸鈾采用不添加瓊脂粉的PDA液體培養基，121 ℃高壓滅菌30 min。

花崗巖鈾礦石取自于廣東某鈾礦山。原礦通過破碎研磨烘干后，過200目篩得到粒徑小于74 μm的礦樣。礦樣的X射線熒光光譜分析結果列入表1。由表1可知，礦石中主要含Si、Ca、Al等成分，鈾的質量分數為0.22%，w(U(Ⅳ))/w(U(Ⅵ))=2.67∶1，U(Ⅳ)所占比例較高。

表1 礦樣的主要化學成分

1.2 實驗方法

(1)孢子懸液的制備

將冷凍保藏的黑曲霉菌種采用PDA液體培養基活化后，接種到PDA固體培養基上，置于30 ℃恒溫培養箱內培養96 h至孢子成熟，用無菌蒸餾水沖洗PDA平板表面成熟的孢子制得孢子懸液，經0.45 μm微孔濾頭過濾后，滴入改良紐鮑爾計數板計數，調節孢子濃度為每100 mL 107個孢子，用于黑曲霉浸鈾實驗。

(2)黑曲霉兩步法浸出實驗

稱取2.000 0 g礦樣，用稱量紙包好，于121 ℃高壓滅菌30 min備用。將制備好的無菌PDA液體培養基倒入250 mL錐形瓶中，每瓶100 mL。然后，接種黑曲霉孢子懸液1 mL，在30 ℃、150 r/min的條件下進行不加礦石的恒溫振蕩預培養。為研究預培養時間對黑曲霉浸鈾的影響，設計不同的預培養時間實驗組，每組的預培養時間分別為12、24、36、48、60、72 h。當每組達到預培養時間后，加入2.000 0 g已滅菌礦樣，再浸出5 d。在浸出過程中，每天監測浸出液的pH值。浸出結束后，固液分離收集尾渣和浸出液，用三氯化鈦還原/釩酸銨氧化滴定法檢測尾渣鈾質量分數，計算鈾浸出率，確定黑曲霉的最佳預培養時間。每組實驗均設3個平行樣，結果取平均值，下同。

在最佳預培養時間的基礎上研究浸出時間對黑曲霉浸鈾的影響，浸出時間分別為24、48、72、96、120、144、168 h。在浸出過程中，每天監測浸出液的pH值。當每組達到浸出時間后，固液分離收集尾渣和浸出液，用三氯化鈦還原/釩酸銨氧化滴定法檢測尾渣的鈾質量分數，計算鈾浸出率，確定最佳浸出時間。

(3)氧化劑強化浸出實驗

在黑曲霉最佳預培養時間基礎上，同時加入滅菌礦樣和氧化劑，浸出時間為上述確定的最佳浸出時間。選取NaClO3、MnO2、H2O2為氧化劑。MnO2加入量分別為1.5%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%(與礦石質量比)，NaClO3加入量分別為1.5%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%(與礦石質量比)，H2O2加入量分別為1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%(與培養基體積比)，浸出結束后用三氯化鈦還原/釩酸銨氧化滴定法檢測尾渣的鈾質量分數(w(U))，計算鈾浸出率。

(4)尾渣鈾質量分數測定及鈾浸出率計算

將烘干至恒重的尾渣研磨至粒徑小于74 μm，稱取0.3～0.5 g尾渣置于100 mL燒杯中，加入5 mL高氯酸加熱蒸干，消除有機質的干擾。其后用三氯化鈦還原/釩酸銨氧化滴定法對尾渣中的鈾質量分數進行測定，根據公式(1)、(2)計算尾渣鈾質量分數和鈾浸出率(η)。

(1)

(2)

式中：ρ，釩酸銨標準溶液對鈾的滴定度，g/L；V，滴定消耗的釩酸銨溶液體積，mL；m，尾渣的樣品質量，g；m1，尾渣總質量，g；w0(U)，原礦鈾質量分數；m2，原礦總質量，g。

2 結果與討論

2.1 預培養時間對黑曲霉兩步法浸鈾的影響

黑曲霉的預培養時間(t)對鈾浸出的影響示于圖1。由圖1可知：隨著預培養時間的延長，鈾浸出率呈現先上升后下降的趨勢，預培養36 h時，鈾浸出率達到最大值55.29%。鈾浸出率與黑曲霉預培養時間之間的關系和黑曲霉的生物活性以及生物量有關。由黑曲霉的生長曲線(圖2)可知，0～30 h為其生長延滯期。在此期間，黑曲霉預培養12 h時鈾浸出率為48.78%，預培養24 h為51.50%。這是由于微生物接種到一個新環境，會暫時缺乏分解催化底物的酶或者缺乏充足的中間代謝產物；同時對外界環境如溫度、溶液pH值等較為敏感，因而細胞分裂緩慢，黑曲霉生長速率幾乎為零，導致生物活性低，生物量小。在此階段黑曲霉干重僅為0.00～0.10 g，濕重僅為0.00～1.50 g。另一方面，在延滯期加入礦石，增強了礦石與孢子間的剪切或者沖撞作用，使得黑曲霉延滯期延長。

圖1 預培養時間對黑曲霉兩步法浸鈾的影響

圖2 黑曲霉的純培養生長曲線

30～72 h為指數生長期，該時期的黑曲霉已經適應了新環境，細胞開始以幾何級數增長，體系中的代謝產物有機酸不斷積累，孢子凝聚成多個直徑為2～3 mm的菌絲球[12]。此階段黑曲霉生物活性最高，生物量快速增大，黑曲霉干重達到0.56 g，濕重達到12.84 g，預培養36 h時鈾浸出率達到最大值55.29%。

黑曲霉預培養72 h后生長處于穩定期，在此階段黑曲霉生物量已經達到平衡，生物活性逐漸降低，不利于后續浸礦。同時，黑曲霉菌絲球直徑可達4～5 mm，此時的黑曲霉菌絲對鈾存在較強的吸附作用[13]，黑曲霉預培養72 h時鈾浸出率僅為45.00%，數值明顯下降。

2.2 浸出時間對黑曲霉兩步法浸鈾的影響

選擇36 h的預培養時間，研究浸出時間(t′)對黑曲霉兩步法浸鈾的影響。浸出液最終pH和鈾浸出率隨浸出時間變化示于圖3。由圖3可知，浸出液最終的pH值隨著浸出時間延長緩慢上升，浸出時間為168 h時，pH上升至3.71。pH值的上升一方面是由于隨著浸出時間延長，培養基的營養物質減少，黑曲霉生長速率減緩，導致有機酸分泌量減少[14]；同時，隨著浸出時間延長，黑曲霉產生的孢內堿性代謝產物會因菌絲球的裂解和菌體細胞壁的溶解釋放到孢外[15]；此外，黑曲霉生長進入衰減期后，由于營養缺乏會使其利用自身代謝產物，消耗有機酸[16]。

t=36 h

鈾浸出率隨浸出時間的延長呈現先上升后下降的趨勢。浸出時間小于72 h時，黑曲霉代謝產生的有機酸不斷積累，充足的有機酸有利于鈾的浸出，第72 h時鈾浸出率達到最大值59.34%。浸出時間大于72 h后，鈾浸出率開始下降，浸出168 h時降至47.45%。鈾浸出率下降是由于黑曲霉菌絲對鈾的吸附所致。已有研究[6，17-18]證實，真菌對鈾、銅、鎳等金屬離子具有很強的吸附能力。Hefnawy等[17]開展真菌浸鈾時發現，土曲霉和小刺青霉對鈾的吸附能力隨著礦漿濃度的增加而提高。Mehta等[6]用黑曲霉浸出印度洋錳結核時，黑曲霉對銅、鎳、鈷、錳均有吸附作用。Mukhopadhyay等[18]在利用預培養的黑曲霉處理銅的生物吸附研究中，證實了金屬離子和真菌細胞壁上的羧基、硫醇、羥基、羰基等官能團反應發生吸附作用。

2.3 不同氧化劑及其用量對黑曲霉兩步法浸鈾的影響

不同氧化劑及其用量對鈾浸出率的影響示于圖4。由圖4可知：三種氧化劑對鈾浸出率均有不同程度的提高，其中MnO2的效果最為顯著。MnO2氧化U4+的原理是其使溶液中的Fe2+氧化成Fe3+，Fe3+再將難溶的U(Ⅳ)氧化為易溶的U(Ⅵ)，從而提高鈾浸出率[19]。當MnO2加入量為2.5%時，鈾浸出率最高，為74.09%，比空白組(不加氧化劑時鈾浸出率為59.34%)提高了14.8%。NaClO3和H2O2的氧化效果均不及MnO2，最高鈾浸出率分別僅為64.77%和64.38%。雖然NaClO3和H2O2均為強氧化劑，但強氧化性會破壞微生物外層保護結構，改變保護層通透性，從而引起細胞滲透壓改變，破壞微生物體內的酶、蛋白質、DNA等物質，使細胞結構受損，抑制真菌的生長[20]，因而降低了生物活性。

t=36 h，t′=72 h

MnO2的加入量對鈾的浸出有著顯著影響，鈾浸出率隨著MnO2的加入呈現先上升后下降的趨勢。當加入1.5%(與礦石質量比，下同)的MnO2時，鈾浸出率為65.04%，加入2.5%的MnO2時，鈾浸出率升至74.09%，而隨著MnO2加入量的繼續增加，鈾浸出率顯著下降。錳元素是真菌細胞壁合成、生成孢子和次生代謝產物所必需的微量營養元[7]，少量的錳能夠促進真菌代謝，產生有機酸[21]。但是過量的MnO2卻不利于浸出，這主要是因為MnO2本身是鈾的良好吸附劑[22]，少量添加有助于破壞脈石礦物的結構使礦物暴露，而過量添加會導致已浸出的鈾再次吸附到MnO2表面，造成鈾浸出率降低。同時體系中過量的金屬錳對真菌有一定的毒害作用[23]。

3 結 論

開展了黑曲霉兩步法和化學氧化聯合浸出花崗巖鈾礦石的研究，結果表明該法可提高鈾浸出率。黑曲霉的預培養時間對兩步法浸鈾效果有顯著影響，黑曲霉預培養時間為36 h時鈾浸出率最高，延長或者縮短預培養時間，均不利于鈾的浸出。浸出時間對黑曲霉兩步法浸鈾也有明顯影響，采用預培養36 h的黑曲霉浸出72 h，鈾浸出率最高為59.34%。在此基礎上，添加NaClO3、MnO2和H2O2等氧化劑均可提高鈾浸出率。其中加入2.5%的MnO2時浸鈾效果最佳，鈾浸出率可達74.09%，與未加氧化劑相比，鈾浸出率提高了14.8%。

盡管真菌浸礦是一種具有良好發展前景的生物浸礦方法，但目前仍處于實驗探索階段，投入工業應用還存在一定距離。因此，需在以下方面進一步研究：開展優良浸礦菌種的選育工作，選育出高產酸且具有耐受高礦漿濃度和金屬毒性的菌株；開展真菌浸礦的機理研究，尤其是真菌產有機酸含量及其配比對礦物浸出的影響；尋求來源廣泛、價格低廉的培養基原料，降低菌種培養和浸礦成本。