高效液相色譜-串聯質譜法測定兒童奶酪中的三聚氰胺*

常晨陽 單 嬌 宮小明 潘迎芬

1（聊城海關，山東聊城 252000）

2（黃島海關，山東青島 266000）

3（濰坊海關，山東濰坊 261000）

4（東山海關，福建漳州 363401）

三聚氰胺，分子式為C3N6H6，是工業生產中一種重要的氮雜環有機物，在生物體內會水解出三聚氰酸，具有生物毒性，人體長期攝入會造成腎結石等疾病，被嚴禁用于食品加工生產過程中。但因為其分子含氮量高達66.7%，非法添加到食品中可以虛假提高蛋白質含量，2008 年“三鹿奶粉事件”食品安全事件爆出后，國家對乳制品中三聚氰胺的抽檢一直是食品安全監控的重點項目。

近年來，隨著乳制品消費升級，零售奶酪市場發展迅速，其中兒童奶酪產品占據了一半以上份額，且呈現不斷增長的趨勢。兒童奶酪，多屬于天然奶酪再加工的產品，呈半固體狀，含有較多的蛋白質、脂肪、糖類，基質相對于一般乳液、奶粉更黏稠，提取難度大，比天然奶酪軟很多，具有自身獨有的特點。

目前已報道的檢測三聚氰胺的方法有HPLC法、GC-MS 法、ELISA、毛細管電泳法等，對三聚氰胺的檢測研究對象多為乳粉和液態奶，奶酪尤其兒童奶酪興起較晚，鮮有對其進行檢測的技術研究報道。

本文根據兒童奶酪的基質特點，基于QuEChERS 檢測原理，結合具有高檢測靈敏度的高液相色譜-串聯質譜儀，建立了一種可準確測定兒童奶酪中三聚氰胺的快速檢測方法，該方法簡單，定性、定量準確。相較于國標檢測方法GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》，無需固相萃取操作和衍生化處理，更為快速、經濟，為兒童奶酪制品中有毒有害物質的快速檢測提供了參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LCMS-8040 高效液相色譜串聯三重四級桿質譜儀，日本島津公司；B-400 粉碎均質機，瑞士步琦公司；ME303 電子天平，瑞士梅特公司；L22-500B超聲波清洗機，上海皓莊儀器公司；CF16RXⅡ高速離心機，日本日立公司；MS3 Digital 漩渦混合器，德國IKA 公司。

三聚氰胺標準物質，純度為99.01%，德國Dr.公司；Cleanert C18（size:50 μm，60 A）PestiCarb（200 目～400 目），PSA（40 μm～60 μm），博納艾杰爾科技公司；中性Al2O3（柱層析用，100 目～200目），天津科密歐公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

取市售兒童奶酪棒產品，粉碎機中打碎，用四分法取100 g 做為分析樣品。

稱取試樣1.0 g（±0.01 g）于50 mL 離心管中，放入陶瓷均質子，加入10 mL2%的三氯乙酸，渦旋混勻2min，超聲5min 后，加入3gNaCl固體，25mL乙腈，繼續渦旋混勻2 min，10 000 r/min 高速離心5 min，吸取10 mL 上層乙腈層加入0.5 g PSA，0.5 g C18，1.0 g 中性Al2O3，渦旋混勻，10 000 r/min 高速離心5 min 后，過孔徑0.2 μm 濾膜后待測。

1.2.2 液相色譜-串聯質譜條件

1.2.2.1 液相色譜條件

色譜柱：沃特世Bridge HILIC 柱（3.5 μm×2.1 mm 100 mm）；流動相：溶劑A 為10 mmol/L 醋酸銨，溶劑B 為含10 mmol/L 醋酸銨的乙腈水（V∶V=95∶5）混合溶液；流速:0.4 mL/min；柱溫:30 ℃，進樣體積:2 μL。

梯度洗脫：0min～1min，0%A，100%B；1min～2.5 min，0%A～20%A，100%B～80%B；2.5 min～3 min，20%A，80%B；3 min～3.1 min，20%A～0%A，80%B～100%B；3.1 min～7 min，0%A，100%B。

1.2.2.2 質譜條件

離子化模式:電噴霧電離ESI（+）；掃描模式：多反應監測MRM模式；碰撞氣：Ar；干燥氣（N2）流速：10 L/min；霧化器（N2）壓力：50 psi；接口溫度：350 ℃；DL 溫度250 ℃；毛細管電壓：3 500 V；加熱模塊溫度：400 ℃。

2.2.3 標準溶液配制

將三聚氰胺標準準物質配制成高濃度標準儲備溶液，用50%甲醇水作為配制儲備液的溶劑。工作使用液現用現配，使用液相條件的初始流動相進行稀釋定容。

2 結果與分析

2.1 提取條件的優化

兒童奶酪多呈凝膠狀，蛋白、脂肪含量高，在純有機溶液乙腈中不溶解，可以將基質在2%三氯乙酸酸性水溶液中預處理，利用陶瓷均質子與超聲的協同提取作用，目標物被充分提取后，加入乙腈進行溶劑轉換。利用鹽包，使乙腈層和水相有效分離，之后用凈化包（C18、PSA、中性Al2O3）吸附脂肪、蛋白等雜質進行純化。

2.2 色譜條件優化

三聚氰胺是強極性物質，在C18色譜柱上不易被保留，利用三聚氰胺的親水性質，參考FDA 推薦的檢測三聚氰胺的方法，選擇親水作用色譜柱（HILIC），可以在高乙腈濃度下被保留，通過提高水相的比例，將三聚氰胺從色譜柱洗脫下來，進入檢測器，達到分離檢測定性定量目的。本試驗中的流動相，選取對比了試驗中最常用到的流動性體系：0.1%甲酸水溶液、0.2%甲酸水溶液、10 mol/L醋酸銨、5 mol/L 醋酸銨（含0.1%甲酸水）、甲醇、乙腈體系進行組合試驗。發現正離子模式下常用的甲酸水對信號沒有明顯提高，而10 mol/L 醋酸銨溶液對出峰影響較為顯著，乙腈作為流動性有機相優于甲醇，最后維持流動性體系10 mol/L 醋酸銨溶液濃度下，選擇乙腈水的流動性配比，確定步驟1.2.2.1 中流動性的比例和及梯度洗脫程序，三聚氰胺在4.1 min 出峰，2 個監控離子對的峰型良好，離子強度高，對應更低的檢測限。三聚氰胺標準溶液的離子流色譜圖見圖1。

圖1 三聚氰胺標準溶液的離子流色譜圖

2.3 質譜條件優化

使用質量濃度500 μg/mL 的三聚氰胺標準溶液，分別在質譜正負離子模式下對目標物進行全掃描（Scan），結果顯示，在正離子模式下的靈敏度高于負離子掃描模式，確定使用ESI 源的正離子模式進行掃描。三聚氰胺分子量為126，掃描到加氫峰質譜信號m/z 127 強信號，為母離子，通過產物離子模式（Product Scan）掃描，找到峰度較強、干擾較小的2 個子離子峰，優化掃描離子和電壓，對離子進行微調，得到m/z 84.8 為定量子離子，m/z 67.7作為定性子離子，確定最佳駐留時間、碰撞電壓和母子離子電壓等質譜參數，確定檢測三聚氰胺的MRM條件。三聚氰胺質譜參數見表1。

表1 三聚氰胺質譜參數

2.4 方法的線性范圍及定量限

在三聚氰胺質量濃度20 ng/mL～200 ng/mL 范圍內，以峰面積Y 為縱坐標，質量濃度X 為橫坐標繪制標準工作曲線，得到三聚氰胺的線性方程為Y=174.369X-791，相關系數R2=0.999 1，標準曲線見圖2。在空白基質中添加三聚氰胺標準溶液，按信噪比（S/N）大于10 計算，確定本方法的定量限為20 μg/kg，方法靈敏度滿足目前國家對奶酪食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg 的監控要求。

圖2 三聚氰胺標準工作曲線

2.5 實際樣品測定

對市售常見不同品牌兒童奶酪產品（奶酪棒、奶酪杯）應用本方法進行三聚氰胺的檢測，未發現陽性樣品。對樣品進行100 μg/kg 濃度水平加標回收試驗，結果見表2。

表2 三聚氰胺加標的回收率和精密度試驗結果（n=6）

由表2 可知，加標回收率在80.6%～91.2%，相對標準偏差RSD 均小于10%，滿足定性和定量檢測要求。

3 結論

兒童奶酪具有不同于其他乳制品的特有基質特點，在前處理中利用QuEChERS 檢測原理，對前處理過程進行優化后，經過簡單提取凈化處理，便可在高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜聯用儀上進行測定。試驗結果表明，在20 ng/mL～200 ng/mL 范圍內三聚氰胺質量濃度與峰面積有良好的線性關系，相關系數為0.999 1 方法定量限為20 μg/kg，添加水平為100 μg/kg 的加標回收率為80.6%～91.2%測定結果RSD＜10%。該方法操作簡單、快速、準確性好、靈敏度高，且無需傳統固相萃取操作，節約時間、經濟成本，同樣適用于大批量樣品篩選檢測。

我國奶酪市場處于初創時代，尚未為兒童奶酪建立完整的標準制度。隨著乳制品的消費升級，奶酪及其制品有著廣闊的市場空間，兒童牛乳市場成熟穩定后，下一階段將走向兒童奶酪的研究。隨著監控政策的不斷完善，兒童食品行業標準也將會進一步細化，檢測標準的制定對研究者提出更多的技術需求，監管檢驗機構群策群力為中國兒童產品質量安全保駕護航。