一種高效檢測水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的方法

穆小婷 韓文節 歐志鵬 華四妹 陳智標 謝衛兵 廖偵成

1（清遠市農產品質量檢驗檢測中心，廣東清遠 511500）

2（清遠市農業科技推廣服務中心，廣東清遠 511500）

孔雀石綠和結晶紫屬于人工合成的三苯甲烷類堿性工業染料，主要用來預防和治療各類水產動物的水霉病、鍶霉病、寄生蟲病、小瓜蟲病、指環蟲病、斜管蟲病、三代蟲病及其他一些細菌性疾病等，也可用于水產品的輸入和水產品暫養等過程，以延長水產品特別是魚類產品的存活時間。孔雀石綠和結晶紫被魚類吸收后，會代謝還原為脂溶性的隱色孔雀石綠和隱色結晶紫，在魚類的脂肪組織中穩定殘留，其化學官能團“三苯甲烷”被證明具有高毒、高殘留、致癌、致畸、致突變等毒副作用，危害食用者身體健康，同時含有孔雀石綠和結晶紫的廢水排放會污染水環境。目前針對孔雀石綠和結晶紫殘留量檢測方法主要有高效液相色譜法、液質聯用法及一些速測技術，國內常用標準主要有GB/T 19857—2005、GB/T 20361—2006、SC/T 3021—2004 等，但均存在前處理復雜繁瑣、所用試劑及前處理儀器多等缺點。本方法前處理只用一種提取劑，提取步驟相對簡單，且所用試劑使用種類和數量少，大大減少了對環境的污染。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

乙腈，液相色譜純，德國默克公司；甲酸，優級純，美國ACS 恩科化學；乙酸銨，分析純，西隴科學股份有限公司；甲醇，液相色譜純，德國默克公司；孔雀石綠草酸鹽溶液，100 μg/mL，農業部環境保護科研監測所；隱色孔雀石綠溶液，100 μg/mL，農業部環境保護科研監測所；結晶紫溶液，100 μg/mL，農業部環境保護科研監測所；隱色結晶紫溶液，100 μg/mL，農業部環境保護科研監測所；孔雀石綠-D5，50 μg/mL，農業部環境保護科研監測所；隱色孔雀石綠-D6，50 μg/mL，農業部環境保護科研監測所；微孔濾膜，0.22 μm，安捷倫公司；中性氧化鋁小柱，1 g/6mL，Waters 公司。

電子天平，120 g/0.1mg，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；漩渦混合器，上海精科實業有限公司；高速離心機，北京醫用離心機廠；超純水機，德國默克公司；KQ-600E 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；固相萃取裝置，上海熙揚儀器有限公司。

1.2 前處理方法

準確稱取5.00 g 待檢水產品于50 mL 離心管中，加1.0 μg/mL的孔雀石綠-D5 和隱色孔雀石綠-D6 混合標準溶液50 μL 作為內標，旋渦混合30 s，加10 mL 乙腈提取，旋渦振蕩1 min，超聲（頻率：40 KHz）提取10 min，4 000 r/min 離心5 min，將上清液移入15 mL 離心管備用；將中性氧化鋁小柱安裝在固相萃取柱上，用5 mL 乙腈活化，取離心后的上清液5 mL 到已活化好的中性氧化鋁柱，收集流出液，過孔徑0.22 μm 濾膜于10 mL 的干凈離心管中，分別取0.5 mL 濾液和0.5 mL 超純水到上機瓶，搖勻，供高效液相色譜質譜聯用儀測定。同時做空白試驗，空白試樣中不含孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫的空白水產品樣品。

2 結果與分析

2.1 提取劑和凈化柱的選擇

目前檢測水產品中殘留的孔雀石綠、結晶紫時，常使用的提取劑包括乙酸銨緩沖液、乙腈、甲醇、二氯甲烷等，輔助提取劑對甲苯磺酸、鹽酸羥胺等，而乙腈被公認為是提取孔雀石綠的最佳溶劑。張藝蓓等研究發現，隱色孔雀石綠在乙腈中的溶解度要高于甲醇，且根據試驗可知，若提取時加入緩沖鹽或離子對試劑等，需用二氯甲烷溶液進行萃取凈化，因水與二氯甲烷屬于共軛溶液，較難或需較長時間離心才能分層。本研究綜合考慮后選擇乙腈作為提取劑，一方面可提高對目標物的提取效率，同時減少溶液因多次轉移造成損失。目前常見的凈化柱包括氧化鋁柱、PRS 柱、HLB 柱、C18柱、MCX 柱等，因酸性氧化鋁柱經過乙腈活化后對脂肪的吸附能力變弱，而堿性氧化鋁柱對孔雀石綠有吸附作用而易導致目標物的損失，所以實驗優先選用中性氧化鋁小柱。左舜宇等通過對中性氧化鋁柱、HLB 柱、C18柱、MCX 柱凈化效果比對試驗發現，中性氧化鋁小柱凈化效果最好。本試驗最終采用中性氧化鋁柱進行待測物的凈化。

下頁 圖1～圖6 為待測物及內標物的定性定量離子色譜圖。

2.2 標準曲線及檢出限試驗

本試驗以羅氏蝦為測定樣品，選0 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、40.0 μg/kg、100.0 μg/kg 9 個點做標準曲線，檢測結果顯示，孔雀石綠（MG）、隱色孔雀石綠（LMG）、結晶紫（CV）、隱色結晶紫（LCV）標準曲線分別為y=1.039x -0.871、y=1.002x -0.051、y=1.015x-0.343、y=0.981x+0.410，相關系數r 分別為0.998 5、0.999 5、0.999 5、0.999 5，均滿足國家標準《GB/T 27404-2008 實驗室質量控制規范食品理化檢測》中附錄F（檢測方法確認的技術要求）相關系數不低于0.98 的要求。

孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫4 種檢測指標在GB/T 19857—2005 液相色譜串聯質譜法中檢出限均為0.5 μg/kg，在GB/T 19857—2005 高效液相色譜法中檢出限均為2.0 μg/kg，在GB/T 20361—2006 高效液相色譜熒光檢測法中均為0.50 μg/kg，本試驗根據3 倍信噪比來計算檢出限，由結果可知，4 種檢測指標檢出限均可達到0.5 μg/kg。

圖1 孔雀石綠定性定量離子色譜圖

圖2 隱色孔雀石綠定性定量離子色譜圖

圖3 結晶紫定性定量離子色譜圖

圖4 隱色結晶紫定性定量離子色譜圖

圖5 孔雀石綠-D5離子色譜圖

圖6 隱色孔雀石綠-D6離子色譜圖

2.3 加標回收率及精密度試驗

試驗以國家標準GB/T 19857—2005 中方法測定低限為基礎，國家標準GB/T 27404—2008 附錄F 中檢測方法確認的技術要求為試驗依據，選取有代表性的草魚和羅氏蝦為測定樣品，在方法測定低限（0.5 μg/kg）、2 倍方法測定低限（1.0 μg/kg）、10倍方法測定低限（5.0 μg/kg）進行三水平試驗，結果分別見表1、表2。

表1 草魚中4 種待測物回收率及精密度

表2 羅氏蝦中4 種待測物回收率及精密度

由表1、表2 結果可知，方法回收率在87.30%～119.20%之間，可達到國家標準要求。

本試驗提取過程只需一種提取劑，凈化后過孔徑0.22 μm 微孔濾膜后即可上機，不需要進行氮氣濃縮處理，大大簡化了樣品前處理步驟，結果表明，該方法標準曲線、檢出低限、回收率、精密度等各檢測技術指標同時可滿足國家標準GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中附錄F（檢測方法確認的技術要求）要求。

3 結論

試驗結果表明，本方法簡單快速，適用于水產品中孔雀石綠和結晶紫的大批量檢測，具體優勢包括以下幾個方面：方法前處理提取過程需一種提取劑乙腈，極大地簡化了提取過程，同時減少了溶液因多次轉移造成的損失；方法前處理凈化過程只需過柱后再過0.22 μm 微孔濾膜即可上機檢測，檢出限和回收率等相關參數均可達到國家相關標準要求，不需再進行濃縮凈化，既簡化了步驟，又省去了試劑和氮吹等復雜儀器的使用；方法中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫4 種檢測指標可一同進行分析檢測；方法采用曲線和樣品一同進行前處理的內標法進行校正，保證曲線和樣品始終在同一條件下進行處理，有效降低了前處理操作過程中的操作誤差和其他條件導致的不統一性及基質效應對結果的影響。