油菜根腫病抗性遺傳改良與應(yīng)用

王燕燕，楊植全，楊慶勇，張椿雨

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家油菜工程技術(shù)研究中心,武漢430070; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢430070;3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，武漢430070

油菜是我國重要的油料作物，年種植面積約666.7萬hm2，產(chǎn)菜籽油500萬t，約占自產(chǎn)食用植物油總量的50%，另提供約800萬t的飼料餅粕[1]。近年來我國油菜生產(chǎn)飽受根腫病困擾。根腫病是由鞭毛菌亞門根腫菌屬蕓薹根腫菌(Plasmodiophorabrassicae，為原生生物)侵染引起并專性為害十字花科植物(如油菜)的一種世界性土傳病害。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國油菜根腫病發(fā)病面積約66.7萬hm2以上，主要集中在四川、湖北、湖南、云南和安徽等省的不同區(qū)域。發(fā)病區(qū)域油菜嚴(yán)重減產(chǎn)或絕收，并且隨著我國農(nóng)業(yè)機(jī)械化程度的不斷提高，該土傳病害正向全國油菜產(chǎn)區(qū)呈暴發(fā)式蔓延態(tài)勢，已成為影響我國油菜產(chǎn)業(yè)安全生產(chǎn)的頭號殺手。生產(chǎn)上防控根腫病的方式主要有農(nóng)業(yè)防治(輪作、凈土育苗移栽、遲播和施用石灰氮等)[2-5]、化學(xué)防控、生物防控和應(yīng)用抗性品種等。這些措施中，比較有效的是凈土育苗移栽、遲播和施用石灰氮。但凈土育苗移栽通常費(fèi)時費(fèi)工、遲播可能會對適時播種產(chǎn)生不良影響，石灰氮由于價(jià)格較高、增加投入難以推廣應(yīng)用；此外，四川病區(qū)采取低溫(氣溫連續(xù)低于15 ℃)條件下對葉面噴施一定濃度的生根劑，以促進(jìn)新根生長從而挽救發(fā)病油菜植株，有一定的效果；但其中最有效、最經(jīng)濟(jì)的策略是抗性品種的選育與應(yīng)用[6]。

1 根腫病抗性資源的發(fā)掘

2019年以前關(guān)于油菜根腫病抗性資源發(fā)掘方面的研究進(jìn)展總結(jié)于文獻(xiàn)[6] 。總體而言，十字花科植物雖然種類繁多，但從中篩選到的抗性資源卻寥寥無幾。最新發(fā)表的質(zhì)量性狀抗源主要來自白菜類材料(AA,2n=20)[7-10]、芥菜型油菜(AABB，2n=36)[11]和蘿卜(RR,2n=18)[12]等。白菜型和芥菜型油菜抗性資源可通過與甘藍(lán)型油菜(AACC,2n=38)直接進(jìn)行有性雜交的方式而將抗性位點(diǎn)導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜。而蘿卜與甘藍(lán)型油菜雜交很困難，需要借助胚挽救及后續(xù)利用甘藍(lán)型油菜為回交親本進(jìn)行不斷回交方可成功。通過遠(yuǎn)緣雜交轉(zhuǎn)育抗性基因的同時，往往有負(fù)面影響的連鎖累贅性狀也可同時被導(dǎo)入受體親本[13]。目前表現(xiàn)為數(shù)量性狀的抗源主要來自甘藍(lán)型油菜[14-15]。質(zhì)量性狀抗性一般都有特異性，即對特定根腫菌生理小種類型有抗性，因此，長期種植含單一質(zhì)量性狀位點(diǎn)的抗性品種容易喪失抗性；而對于甘藍(lán)型油菜含有的數(shù)量抗性材料，在根腫菌濃度較低的田塊都表現(xiàn)出非常好的耐病性，而一旦在高濃度根腫病污染的田塊其抗性一般都會表現(xiàn)很差。因此，本文重點(diǎn)關(guān)注基于質(zhì)量性狀抗性的甘藍(lán)型油菜遺傳改良研究。

然而，令人不解的是作為古老的病原物(根腫菌的病原最早在1878年由俄國科學(xué)家Worolin發(fā)現(xiàn)并命名為蕓薹根腫菌)，根腫菌在自然界中長期存在，但在種類和數(shù)量繁多的十字花科植物中僅找到數(shù)量極其有限的抗源材料，這是一個值得深入研究的重要科學(xué)問題。但只有待眾多抗病基因被定位和克隆后，才可能從根本上揭示抗性資源材料的演化歷程。

2 抗性基因的定位

截至目前，國內(nèi)外在含A基因組的不同抗性材料定位的質(zhì)量抗性位點(diǎn)有26個(表1)。除了A基因組抗性材料外，近期在蘿卜和芥菜型油菜中也分別定位了5個和1個抗性位點(diǎn)，其中芥菜型的抗性位點(diǎn)Rcr6與A基因組中定位的Crr1基因極可能為同源基因[11-12]。顯然，在這些A基因組材料中定位的抗性位點(diǎn)也一定存在較多重疊。目前已經(jīng)完成基因組測序的A基因組植物對根腫病均表現(xiàn)為感病，因此，缺乏抗病參考基因組，導(dǎo)致無法對這些不同抗性位點(diǎn)進(jìn)行有效地歸類、整合和抗性候選基因克隆，給合理利用上述抗源材料開展油菜根腫病抗性遺傳改良研究帶來較大困難。目前這些位點(diǎn)中只有CRa與Crr1a兩個基因被成功克隆，均編碼TIR-NB-LRR結(jié)構(gòu)蛋白,為典型的R基因類型，但由上述抗性蛋白介導(dǎo)的抗病機(jī)制尚不清楚，其中Crr1a主要在根部、子葉、下胚軸等部位表達(dá)[29]。以含多個抗病位點(diǎn)的A基因組材料蕪菁(如ECD04等)為研究對象，在完成基因組測序的基礎(chǔ)上進(jìn)行抗病位點(diǎn)整合和抗病候選基因克隆是未來研究的重點(diǎn)工作之一，也可為抗病機(jī)制的研究奠定重要基礎(chǔ)。

表1 在A基因組不同抗源材料中定位或克隆的根腫病抗性位點(diǎn)及染色體分布Table 1 Clubroot resistance loci and chromosomal distribution located or cloned from different resistance sources in genome A

3 甘藍(lán)型油菜根腫病抗性育種

種間雜交是轉(zhuǎn)移有利性狀的有效途徑。因此，通過定向轉(zhuǎn)育方法將根腫病抗性基因?qū)胗筒耸沁x育抗病品種的最有效途徑。第1代抗根腫病油菜品種‘Mendel’和‘Tosca’是利用ECD04(蕪菁，A基因組材料)和ECD15(甘藍(lán)，CC,2n=18)種間雜交和染色體加倍，在創(chuàng)制出新型抗根腫病甘藍(lán)型油菜資源的基礎(chǔ)上選育出來[30]。隨后，由于抗性資源被不斷發(fā)掘與抗病基因定位工作的不斷深入，油菜抗根腫病育種也取得了較好進(jìn)展。加拿大油菜生產(chǎn)也同樣受根腫病嚴(yán)重危害，截至2020年，Bayer、Pioneer和Cargill等9個大型種業(yè)公司共選育了53個抗根腫病新品種(https://www.canolacouncil.org/canola-encyclopedia/diseases/clubroot/)，但這些品種是利用什么抗病位點(diǎn)尚無信息可查。我國油菜根腫病發(fā)生較加拿大晚，因此，根腫病抗病育種工作開展得也相對晚。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)通過將甘藍(lán)型油菜優(yōu)良親本分別與抗病蕪菁ECD04和抗病大白菜開展種間雜交，選育了我國首批抗根腫病常規(guī)新品種華雙5R和雜交新品種華油雜62R并于2018年完成登記[13,31-32]。這2個抗病品種分別含PbBa8.1和CRb兩個抗病位點(diǎn)，對我國根腫菌4號優(yōu)勢生理小種均有免疫抗性，其中華油雜62R累計(jì)推廣約3萬～5萬 hm2[32]。同時,上述抗源材料分發(fā)給全國各主要油菜育種單位后，也帶動了我國油菜抗根腫病新品種(如圣光165R、華油雜19R和華油雜160R等)的選育。隨后，Shah等[33]系統(tǒng)研究了由這2個抗病位點(diǎn)衍生出的含單個抗病位點(diǎn)純合、雜合，以及含2個抗病位點(diǎn)純、雜合的6種基因型材料對云南騰沖、保山、臨滄、楚雄,四川，湖北枝江、巴東，安徽黃山，遼寧新民等地根腫菌的抗病反應(yīng)，結(jié)果表明：抗病純合基因型的抗性強(qiáng)于雜合基因型，2個基因的抗性優(yōu)于單個抗性基因，說明不同抗病基因的抗病反應(yīng)可能存在互作關(guān)系，或者2個抗病位點(diǎn)存在劑量效應(yīng)。前人研究也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，如Crr1對根腫菌的抗性表現(xiàn)為不完全顯性，只有純合時才對致病性較弱的菌株有抗性，Crr2單獨(dú)存在時不對任何生理小種起抗性作用，但是當(dāng)Crr1和Crr2同時存在時則對致病性較強(qiáng)的菌株表現(xiàn)出抗性[16,28,34]。從根腫菌的類型看， 四川、安徽、湖北等省的油菜主產(chǎn)區(qū)的變異較小，云南根腫菌多樣性高，遼寧(新民)的根腫菌變異最大且與其他地區(qū)來源的菌株差別較大。以上研究結(jié)果的取得為我國油菜根腫病抗病育種指明了方向。

鑒于長期種植含單個抗病位點(diǎn)的油菜品種很容易造成抗性的喪失，未來油菜根腫病抗病育種的方向主要還是以多個抗性位點(diǎn)的分子聚合育種為主，這是因?yàn)榭共〔牧鲜忀糆CD04對來自我國不同地區(qū)的根腫菌具免疫抗性，其基因組中至少含3個或以上的抗性位點(diǎn)[17,21]，而其中的抗病位點(diǎn)PbBa8.1只對部分地區(qū)的根腫菌存在免疫抗性。相信隨著抗病資源及其抗病位點(diǎn)發(fā)掘的越來越多，運(yùn)用與抗性位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行聚合選育具有持久抗性的油菜品種是未來工作的重點(diǎn)。

4 根腫病抗性油菜品種的應(yīng)用

為了更好地利用抗病品種并最大限度延長其使用年限，建議在推廣和應(yīng)用根腫病抗性油菜品種的過程中要重點(diǎn)關(guān)注以下問題：(1)根腫病的重發(fā)區(qū)以種植適宜的抗病品種為主。(2)在由政府采購并統(tǒng)一供種的地區(qū)，在對含不同抗病位點(diǎn)的品種有充分選擇余地的前提下，農(nóng)業(yè)管理部門可按年度交替使用含不同抗病位點(diǎn)的抗性品種，以適當(dāng)延緩油菜品種抗性喪失的速度。(3)將抗病品種與10%左右的感病品種混合種植，可在一定程度上提高油菜群體抗病性的同時降低抗病品種抗性喪失的速度。最近研究表明，一定比例的抗、感病油菜品種混播，有利于提高群體的抗性水平[35]；現(xiàn)有觀點(diǎn)認(rèn)為，抗病品種混有一定比例的感病品種，讓感病品種正常發(fā)病，這可能既有利于保持根腫菌的種群穩(wěn)定，還可減少根腫菌生理小種的變異速度，也不會因?yàn)榉N植密度發(fā)生較小的改變而影響最終產(chǎn)量。當(dāng)然，這一觀點(diǎn)尚缺乏有力證據(jù)支撐。為了獲得有力證據(jù)，建議通過在根腫病發(fā)生區(qū)域?qū)Σ煌埂⒏斜壤旌嫌筒似贩N進(jìn)行長期定位種植，通過觀察不同混合比例的抗、感油菜組合中抗病油菜抗性喪失的快慢及根腫菌變異情況來確定。(4)除在根腫病重發(fā)區(qū)種植抗病品種外，還建議在重發(fā)區(qū)周圍的輕發(fā)區(qū)和未發(fā)病區(qū)域大面積種植抗病品種，以控制根腫病的進(jìn)一步發(fā)展。

5 存在的問題及展望

目前我國油菜根腫病防控過程中存在的主要問題是：由于根腫病隨流水和機(jī)械作業(yè)傳播速度快，加之根腫菌休眠孢子可以在土壤中存活20 a左右，且市場上可供選擇的適合不同生態(tài)區(qū)種植的抗病品種還比較少，因此,預(yù)測我國油菜根腫病發(fā)病面積會越來越大并必將成為影響我國油菜安全生產(chǎn)的嚴(yán)重威脅。油菜根腫病抗性的遺傳改良也必將成為我國油菜育種的核心和必需目標(biāo)。