水稻LEA_2家族的鑒定與表達譜分析

薛亞莉，魏曉雙，周海連，李朝陽，胡利華，王令強,，張翠翠

1.華中農業大學植物科學技術學院，武漢 430070；2.亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004；3.廣西大學生命科學與技術學院，南寧 530004；4.廣西大學農學院，南寧 530004；5.廣西甘蔗生物學重點實驗室，南寧 530004

到2050年，世界人口將從目前的73億增加到預計的97億，糧食需求也將增長59%至98%[1]。水稻(OryzasativaL.)是主要糧食作物之一，發掘水稻抗逆基因，培育高抗水稻品種，對解決糧食安全問題意義重大。

胚胎發育晚期豐富(late embryogenesis abundant proteins,LEA)蛋白參與抵御非生物逆境脅迫[2]，1981年首次在棉花子葉中發現[3]，隨后在其他植物、動物和微生物中均有發現[4]。LEA蛋白最初被發現在種子脫水成熟過程中大量表達積累[5]，進一步的研究表明，植物在遭受干旱、低溫、脫落酸(abscisic acid,ABA)處理、高鹽等逆境脅迫后，LEA蛋白在植物不同的組織部位都可能大量表達[6]。

LEA蛋白在非生物逆境脅迫中發揮作用。在擬南芥中，過表達小麥LEA基因DHN-5可顯著提高植株對滲透脅迫的耐受性[7]。將大麥LEA蛋白基因HVA7導入水稻，轉基因水稻株系對干旱和鹽分的耐受性顯著增強[8]。在草莓中過表達小麥的LEA基因(WCOR410)可顯著提高葉片的抗寒性[9]。LEA基因的異源表達不僅可以增加高等植物的脅迫耐受性，對真菌及原核生物同樣有效。在酵母中過表達水稻的LEA基因OsLEA3-2，提高了其對鹽脅迫和滲透脅迫的耐性[10]。葡萄固氮菌lea1基因的突變使細胞對高溫、滲透脅迫更敏感[11]。將8個具有代表性的中國春小麥的TaLEAs基因導入大腸桿菌和酵母中，增強了大腸桿菌和酵母對鹽和熱的耐受性[12]。

植物LEA蛋白在PFAM數據庫(protein families database)中根據8個PFAM號(PF03760、PF03168、PF03242、PF02987、PF00477、PF00257、PF04927和PF10714)分為8個家族，分別是LEA_1～LEA_6、Dehydrin 和SMP。2007年，Wang等[13]從水稻中鑒定出34個LEA家族成員，其中OsLEA5～OsLEA8屬于LEA_2亞家族。含有LEA_2(PF03168)結構域的蛋白是植物體內鑒定出的最多一類LEA蛋白，且大多數屬于疏水性蛋白[14]。本研究利用粳稻品種日本晴的基因組序列、秈稻品種明恢63的全生育期基因表達芯片、日本晴抽穗期的部分組織樣品以及不同株齡的日本晴植株在干旱等多種逆境處理后的轉錄組測序數據或基因表達譜芯片數據，結合生物信息學分析和實時熒光定量PCR，對水稻LEA_2家族成員(OsLEA2)進行全基因組鑒定，并對其染色體分布、理化性質、系統進化及保守基序、基因結構及基因表達模式等進行分析，著重分析干旱處理、冷處理和淹水處理的日本晴水稻植株中部分OsLEA2基因的表達，旨在為進一步研究水稻LEA_2家族成員的功能提供參考，同時為水稻抗干旱育種提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 水稻LEA_2家族成員的鑒定、染色體定位和蛋白的理化性質分析

擬南芥、小麥和水稻的全基因組數據分別從TAIR網站(https://www.arabidopsis.org/)、Ensembl網站(http://plants.ensembl.org/index.html)和TIGR網站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)下載。從Pfam數據庫網站(http://Pfam.xfam.org)檢索得到水稻LEA_2基因家族的PFAM號(PF03168)，利用TBtools[15]上的HMM Search檢索(e<0.001)，得到水稻LEA_2蛋白候選序列。根據文獻報道的3個擬南芥AtLEA_2基因家族蛋白序列[16]和159個小麥TaLEA_2基因家族蛋白序列[17]，利用TBtools查找同源序列，得到候選序列。基于HMM Search和Blast的結果，將候選序列合并去重復后，利用在線網站Pfam (http://Pfam.xfam.org/search)對全部候選蛋白序列進行結構域搜索確認，存在LEA_2結構域的蛋白序列被認為是OsLEA_2家族成員。

從TIGR網站下載水稻全基因組蛋白序列、水稻染色體組相關信息。利用TBtools進行水稻LEA_2家族成員的染色體定位，同時運用在線網站 ExPASy (http://web.expasy.org)進行分子質量、等電點和親水性(grand average of hydropathicity,GRAVY)預測。

1.2 水稻LEA_2家族成員的進化樹構建、基序分布、基因結構和啟動子區順式作用元件分析

從TIGR網站下載水稻全基因組序列、全基因組蛋白序列、基因組結構相關信息。用TBtools提取60條LEA_2蛋白序列進行Clustalw算法比對，使用MEGA7.0軟件，采用鄰接法(neighbor-joining,NJ) 構建系統進化樹，設置重復值為1 000；使用MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)進行蛋白質保守基序分析，搜索的基序數設置為10，基序長度設置為6～25，其他參數為默認參數；利用TBtools繪制水稻LEA_2基因結構圖譜，并選取起始密碼子ATG上游2 kb的DNA序列，利用PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant care/html/)進行順式作用元件預測。

1.3 水稻LEA_2家族成員不同生育期組織表達模式分析

從CREP數據庫(http://crep.ncpgr.cn/crep-cgi/home.pl)下載51個水稻LEA_2基因的表達芯片數據，選擇明恢63的24個不同生育時期的平均信號值取10的對數后用于聚類分析，M1 ～ M24表示明恢63的24個不同生育時期，并使用TBtools軟件的HeatMap可視化。用NCBI Primer-BLAST設計特異性引物(表1)，實時熒光定量qPCR檢測部分LEA_2基因在水稻抽穗期不同組織部位的表達情況。取粳稻品種日本晴抽穗期的根、莖、穗，每個樣品由4個單株混合。使用植物總RNA提取試劑盒提取水稻RNA后通過反轉錄試劑盒獲得水稻cDNA。qPCR試劑盒使用SYBRGreen qPCR Mix，20 μL反應體系：10 μL 2×SYBR qPCR Mix，上下游引物各1 μL，8 μL稀釋的cDNA。反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性15 s，56.5 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，40個循環。以泛素蛋白基因Ubiquitin(AK059011)為內參，每個樣品3次技術重復，以2-ΔΔCt法分析qPCR的結果。

表1 qPCR實驗中所用的引物Table 1 Primers used in qPCR

1.4 水稻LEA_2家族成員不同逆境處理下的表達模式分析

粳稻品種日本晴營養期干旱脅迫的轉錄組數據GSE65022從NCBI的GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載?；讷@得的干旱脅迫后的實驗組和對照組的轉錄組數據，對status為“ok”且P<0.05的LEA_2基因的表達量進行比較分析。日本晴苗期的5種不同脅迫的基因表達芯片數據GSE7530從NCBI的GEO數據庫下載?；谒驹?種不同逆境處理下的芯片數據，獲得了23個水稻LEA_2基因(OsLEA2-4、OsLEA2-5、OsLEA2-8、OsLEA2-9、OsLEA2-10、OsLEA2-11、OsLEA2-14、OsLEA2-18、OsLEA2-19、OsLEA2-20、OsLEA2-21、OsLEA2-23、OsLEA2-24、OsLEA2-26、OsLEA2-34、OsLEA2-35、OsLEA2-37、OsLEA2-45、OsLEA2-51、OsLEA2-52、OsLEA2-54、OsLEA2-59、OsLEA2-60)在不同逆境處理下lgFC值(FC表示fold change，是實驗組與對照組表達量的比值)，并將lgFC還原為FC即相對表達量后作圖。

2 結果與分析

2.1 水稻LEA_2家族成員的搜索和鑒定

通過“HMM search”獲得72條水稻LEA_2家族成員的候選蛋白序列，同時利用擬南芥[16]和小麥LEA_2家族成員的蛋白序列[17]查找同源序列，分別獲得7條和89條水稻LEA_2家族成員的候選蛋白序列。不同來源的序列匯總并去除重復后，一共得到了67條可能編碼LEA_2蛋白的候選序列。將這些蛋白序列在Pfam數據庫中進行結構域搜索確認，發現其中3條序列不含LEA_2結構域，最終得出64條水稻LEA_2蛋白序列，它們由60個LEA_2基因編碼。選擇每個基因的第一條轉錄本為該基因的代表序列，根據其在基因組上的位置依次將60個LEA_2基因分別命名為OsLEA2-1～OsLEA2-60(表2)。

表2 水稻 LEA_2家族成員理化性質Table 2 Physicochemical properties of rice LEA_2 family members

續表2 Continued Table 2

2.2 水稻LEA_2基因的染色體定位

60個水稻LEA_2基因在水稻的12條染色體上均有分布(圖1)。其中，1號染色體最多，有13個基因；10號染色體最少，只有1個；5號染色體有7個，7號染色體有6個，2號、3號、4號和12號染色體均為5個，8號和11號染色體各有4個，6號染色體上有3個，9號染色體上有2個(圖1)。

圖1 水稻LEA_2基因的染色體位置Fig.1 Chromosome positions of rice LEA_2 genes

2.3 水稻LEA_2家族蛋白的理化性質

水稻LEA_2家族蛋白的平均長度為243 aa，有52個LEA_2蛋白長度在150 ～ 300 aa，最長的蛋白(OsLEA2-13)含有455個氨基酸，最短的蛋白(OsLEA2-2和OsLEA2-34)含有151個氨基酸。水稻LEA_2家族蛋白分子質量都偏小，最小的只有16.24 ku(OsLEA2-2)，最大的也只有49.14 ku(OsLEA2-13)。水稻LEA_2家族蛋白的等電點分布較廣，在4.70 (OsLEA2-7)到11.70 (OsLEA2-32)；其親水值在-0.647 (OsLEA2-12)到0.597 (OsLEA2-43)，其中只有18個蛋白質GRAVY值<0，傾向于親水；其他42個蛋白質的GRAVY值均>0，傾向于疏水(表2)。

2.4 水稻LEA_2家族的系統進化、保守基序及基因結構分析

系統進化分析表明，60個水稻LEA_2家族成員可分為5個組(I ～ V)，分別包含17、11、15、6與11個水稻LEA_2基因(圖2A)。分析水稻LEA_2家族成員的保守基序情況，共發現10種保守基序(Motif 1 ～ 10)，聚類到同一個組的LEA_2家族成員包含的保守基序類型基本相同，不同組成員間存在一定的差異(圖2B)。另外，95%的LEA_2基因有3 ～ 6個基序，主要是Motif 1、Motif 2和Motif 8，其中96.7%成員含有Motif 1，86.7%的成員含有Motif 2，66.7%的成員含有Motif 8。

基因結構分析表明，水稻LEA_2家族成員的基因結構相對簡單，不含或者很少含有內含子，所有基因的外顯子均不超過3個，其中，83.3%的基因只有1個外顯子區，11.7%的基因有2個外顯子區，5%的基因有3個外顯子區(圖2C)。另外，進化關系較近的基因具有相似數量的外顯子和內含子。這表明水稻LEA_2基因家族在進化上比較保守，這種基因結構的進化保守性可能與LEA蛋白參與許多重要的生物學過程密切相關。

A：水稻LEA_2家族成員的系統進化樹； B：水稻LEA_2家族成員的保守基序分布； C：水稻LEA_2基因的基因結構。A：The phylogenetic relationship of rice LEA_2 family members; B：Distribution of conservative motifs of rice LEA_2 family members; C：Gene structures of rice LEA_2 genes.圖2 水稻LEA_2家族成員的系統進化、保守基序及基因結構Fig.2 Phylogenetic relationship,conserved motifs and gene structures of rice LEA_2 family members

2.5 水稻LEA_2家族基因啟動子區的順式作用元件

對60個LEA_2基因起始密碼子上游2 kb區域內的啟動子序列進行在線分析，發現60個基因的啟動子區域共包括1 712個順式作用元件。其中與生長發育相關的元件有678個光響應調控元件、49個分生組織調控元件、8個種子特異性調控元件等；與激素信號傳導途徑相關的元件包括308個茉莉酸甲酯響應元件、212個脫落酸響應元件、44個生長素響應元件等；與非生物逆境脅迫有關的元件包括38個低溫脅迫響應元件、52個干旱脅迫響應元件、99個厭氧誘導響應元件等(圖3)。在水稻LEA_2基因家族，有83.3%的成員含有ABA的響應元件ABRE，有58.3%的成員含有干旱響應元件MBS，有48.3%的成員含有低溫的響應元件LTR。這些結果說明LEA_2基因家族成員可能在干旱、低溫等逆境脅迫中受到激發從而發揮其保護植物的作用。

圖3 水稻LEA_2啟動子區的順式元件比較分析Fig.3 Comparison analysis of cis-elements in rice LEA_2 promoter regions

2.6 水稻LEA_2家族基因的組織表達譜

從CREP數據庫搜索秈稻品種明恢63全生育期表達譜數據，獲得51個OsLEA2基因在24個不同發育時期的表達情況，并進行分層聚類 (圖4)。結果發現，水稻LEA_2基因的全生育期的表達模式總體可分為4類：第1類包含12個基因，其中除了OsLEA2-2、OsLEA2-3、OsLEA2-10、OsLEA2-16、OsLEA2-42等5個基因在受精不同時間的胚乳(M22、M23、M24)或發芽72 h后的種子(M1)中表達量較高外，其他成員在大多數時期都處于較低水平；第2類包含11個基因，其中OsLEA2-8、OsLEA2-41、OsLEA2-46在雄蕊(M18)或穎殼(M20)這類花器官中表達量最高，OsLEA2-18、OsLEA2-44在營養器官莖(M18)中表達量最高，該類基因在其他時期的表達量都處于中等偏低水平；第3類包含14個基因，該類基因在所有的幼穗組織(M12 ～ M16)中表達量偏低，在其他大部分時期中的表達量偏高；第4類包含14個基因，與第1類的12個基因相反，在大多數時期的表達量都比較高。總體上，在整個水稻LEA_2家族基因間共表達現象明顯，4類基因大致表現出4種表達模式，即每一類里的基因表達模式都比較相似，暗示LEA_2家族內可能存在功能冗余現象。

從第2類和第4類基因中各挑選2個基因，采用qPCR的方法分析它們在粳稻品種日本晴抽穗期的根、莖和穗中的表達水平，結果與秈稻品種的表達譜芯片一致：屬于第2類的OsLEA2-18和OsLEA2-44整體的表達水平偏低，根和穗中的表達水平相近，莖中的表達量相對高出約1倍；屬于第4類的OsLEA2-24和OsLEA2-60在抽穗期的根中表達量低，穗中的表達量是根中的5倍以上，莖中的表達量又是穗中的2倍左右；此外，每一類中的2個基因的表達模式均高度相似(圖5)。

2.7 水稻LEA_2家族基因在不同逆境處理下的表達譜

基于日本晴營養期植株干旱脅迫后的轉錄組數據，篩選得到了18個基因的可靠數據，其中13個基因在脅迫組中的表達量比對照組高，說明它們被干旱脅迫誘導上調表達，另外5個基因在脅迫組中的表達量比對照組低，說明干旱脅迫使它們下調表達(圖6)。干旱誘導上調表達的基因中，有12個上調顯著(2倍以上)，其中OsLEA2-26上調倍數最高達到99.37倍，OsLEA2-2上調60.10倍，OsLEA2-11和OsLEA2-27均上調約30倍，OsLEA2-3和OsLEA2-8均上調約10倍(圖6A)；干旱誘導下調表達的5個基因，OsLEA2-5、OsLEA2-14、OsLEA2-24、OsLEA2-37和OsLEA2-60分別下調77%、81%、81%、91%和73%(圖6B)。

基于日本晴幼苗在不同逆境處理前后的基因表達芯片數據，獲得了23個OsLEA2基因在不同逆境處理下的表達情況。結果發現，只有OsLEA2-24和OsLEA2-60檢測到了2倍以上的表達量差異；OsLEA2-24在10 ℃冷處理24 h后表達量較處理前上調7.29倍，處理48 h后表達量迅速下降到處理前的84%，處理72 h后表達量又上升到處理前的1.51倍；OsLEA2-60在淹水處理24 h后表達量上調3.72倍，隨著處理時間的延長，OsLEA2-60表達量上調依次減小至2.55倍(處理48 h)、1.84倍(處理72 h)，OsLEA2-60基因在干旱處理24 h后表達量上調3.79倍(圖7)。

綠色表示低表達；紅色表示高表達；M1：發芽72 h后的種子；M2：萌發后的胚芽和胚根；M3：三葉期的幼苗；M4：2分蘗期的莖；M5：2分蘗期的根；M6：二次枝梗分化期的葉鞘；M7：減數分裂期的葉鞘；M8：二次枝梗分化期的葉；M9：減數分裂期的葉；M10：抽穗前5 d的劍葉；M11：抽穗14 d后的劍葉；M12：二次枝梗分化期的幼穗；M13：雌雄蕊分化期的幼穗；M14：花粉母細胞形成期的幼穗；M15：減數分裂期的幼穗；M16：抽穗期的幼穗；M17：抽穗前5 d的莖；M18：開花1 d前的雄蕊；M19：抽穗期的莖；M20：開花1 d前的穎殼；M21：開花3 d后的小穗；M22：受精7 d后的胚乳；M23：受精14 d后的胚乳；M24：受精21 d后的胚乳。Green denotes low expression; Red denotes high expression; M1:Seed,72 h after imbibition; M2:Embryo and radicle after germination; M3:Leaf and root at three-leaf stage; M4:Shoot,seedling with 2 tillers; M5:Root,seedling with 2 tillers; M6:Sheath,young panicle at stage 3; M7:Sheath,4-5 cm young panicle; M8:Leaf,young panicle at stage 3; M9:Leaf,4-5cm young panicle; M10:Flag leaf,5 days before heading; M11:Flag leaf,14 days after heading; M12:Young panicle at stage 3; M13:Young panicle at stage 4; M14:Young panicle at stage 5; M15:Panicle,4-5cm young panicle; M16:Panicle,heading stage; M17:Stem,5 days before heading; M18:Stamen,one day before flowering; M19:Stem,heading stage; M20:Hull,1 day before flowering; M21:Spikelet,3 days after pollination; M22:Endosperm,7 days after pollination; M23:Endosperm,14 days after pollination; M24:Endosperm,21 days after pollination.圖4 不同組織中OsLEA2基因的表達譜分層聚類Fig.4 Hierarchical clustering of OsLEA2 genes in different tissues

根中的表達量定為1，標準差來自于3次技術重復。The expression levels in root are arbitrarily set as 1,and the SD are based on three technical replicates.圖5 OsLEA2基因在抽穗期不同組織中的表達水平Fig.5 Expression level of OsLEA2 genes in different tissues at heading stages

A：上調；B:下調。A:Up regulated; B:Down regulated.圖6 OsLEA2基因干旱脅迫后的表達模式Fig.6 Expression patterns of 18 OsLEA2 genes after drought stress

A：OsLEA2-24冷脅迫 OsLEA2-24 cold stress; B:OsLEA2-60淹水脅迫 OsLEA2-60 flooding stress; C:OsLEA2-60干旱脅迫 OsLEA2-60 drought stress.圖7 OsLEA2基因在不同逆境處理下的表達水平Fig.7 Expression level of OsLEA2 genes under different stress conditions

3 討 論

Battaglia等[14]將LEA蛋白分為7個組，其中第5組是非典型的疏水性蛋白，根據序列相似性分為5A、5B和5C三個亞組，5C亞組即LEA_2家族。Wang等[13]2007年從水稻基因組鑒定的LEA_2基因OsLEA5、OsLEA6、OsLEA7和OsLEA8，在本研究中分別命名為OsLEA2-2、OsLEA2-6、OsLEA2-23和OsLEA2-34。目前，僅有關于OsLEA2-34(OsLEA5c)基因功能的研究報道[2,18]。

本研究通過秈稻明恢63全生育期的基因表達芯片對51個OsLEA2基因的表達情況進行分層聚類，發現它們的表達模式大致可分為4類，4類基因間共表達現象明顯。在粳稻品種日本晴抽穗期的根、莖、穗中，用qPCR的方法分別檢測第2類基因OsLEA2-18和OsLEA2-44及第4類基因OsLEA2-24和OsLEA2-60的表達情況，結果發現屬于同類的2個基因的表達模式高度相似(圖5)，驗證了表達譜分層聚類的結果。另外，LEA基因在高等植物的種子中大量表達[5]，秈稻的芯片數據顯示只有第1類的OsLEA2-2和OsLEA2-16僅在受精后的胚乳中表達較高，以及第4類的OsLEA2-19、OsLEA2-20、OsLEA2-23、OsLEA2-27、OsLEA2-34、OsLEA2-54和OsLEA2-55等7個基因幾乎在全部24個組織中都有較高的表達量，有25個基因(包括第1類中除OsLEA2-2、OsLEA2-3、OsLEA2-16、OsLEA2-42之外的8個基因，第2類全部11個基因，第3類的OsLEA2-21、OsLEA2-33、OsLEA2-37、OsLEA2-59等4個基因，第4類的OsLEA2-17 和OsLEA2-60 等2個基因)不同于先前發現的LEA基因，在受精后的胚乳中表達量持續較低(圖4)。此外，這25個基因中，OsLEA2-10僅在發芽72 h的種子中表達量稍高，OsLEA2-46僅在開花前1 d的雄蕊中表達量稍高，OsLEA2-41僅在幼穗和雄蕊中表達量高，OsLEA2-18和OsLEA2-44僅在抽穗期的莖中表達量稍高，暗示這5個基因可能分別只在種子萌發、幼穗或雄蕊發育等過程中發揮功能。

前人的研究發現植物在遭受干旱、低溫、ABA處理、鹽處理等逆境脅迫后，LEA蛋白在植物不同的組織部位都可能大量表達[6]。通過分析水稻LEA_2家族基因啟動子區的順式作用元件發現，有83.3%的基因含有ABA的響應元件，58.3%的基因含有干旱響應元件，48.3%的基因含有低溫響應元件?；谌毡厩鐮I養期植株干旱脅迫后的轉錄組發現，干旱脅迫誘導12個基因顯著上調表達和5個基因顯著下調表達(圖6)；其中，OsLEA2-2和OsLEA2-26在干旱脅迫組中的表達量分別是對照組的60.10倍和99.37倍，OsLEA2-2啟動子包含低溫響應元件(LTR)1個、干旱響應元件(MBS)2個、ABA響應元件(ABRE)14個，OsLEA2-26啟動子包含ABRE 5個，可以將這2個基因作為培育抗旱水稻品種的候選基因開展更深入的研究。

本研究基于冷脅迫、聚乙二醇(PEG)模擬的干旱脅迫、淹水脅迫、甘露醇引起的滲透脅迫和鹽脅迫共5種處理前后的日本晴幼苗的芯片數據，研究了23個OsLEA2基因處理前后幼苗表達量的變化，發現只有OsLEA2-24在冷處理后表達上調超7倍，OsLEA2-60在淹水和干旱處理24 h后表達量均上調近4倍(圖7)。Huang等[2]報道OsLEA2-34在PEG模擬的干旱處理1 h后，表達量迅速上調超6倍，6 h后表達量下降至不到2倍；鹽脅迫1 h后，OsLEA2-34基因上調表達超過3倍，6 h后表達量幾乎回復到處理前的水平。本研究中，OsLEA2-34基因在任何處理的任何時間點均未發現其表達量的明顯變化(數據未展示)?；虻膬群佣鄷舆t調控反應，表達水平在應激反應中迅速變化的基因含有明顯較低的內含子密度[19]。水稻LEA_2家族的基因不含或者很少含有內含子，其表達水平在應激反應中的變化應該比較迅速，但本研究中，5種逆境處理前后的水稻幼苗的表達水平變化差異較小。綜合上述結果推測，水稻LEA_2家族基因啟動子上存在大量ABA及非生物逆境脅迫響應元件，可能賦予它們在數小時之內迅速響應干旱或冷脅迫等環境的能力，而10日齡日本晴幼苗芯片數據中的樣品大部分在處理24 h后采集，這可能是絕大部分基因未檢測到表達量顯著變化的原因。