鹽預處理對大麥種子萌發和小孢子愈傷形成的影響

徐紅衛，郭桂梅，高潤紅，何婷，杜志釗，李靜，陳志偉，陸瑞菊，王亦菲，劉成洪

1.上海市農業科學院生物技術研究所/上海市農業遺傳育種重點實驗室，上海 201106； 2.揚州大學農學院，揚州225009； 3.上海市農業科技服務中心，上海 200335

鹽脅迫已經成為制約我國農作物生長與產量的重要因素之一[1]。在作物發育的關鍵時期對種子、幼苗或者細胞進行化學物質預處理，是改善作物耐鹽性的有效措施[2-3]。大麥(HordeumvulgurL.)在禾谷類作物中耐鹽性較強，是開拓鹽荒的先鋒作物[4]，但是品種之間的耐鹽性差異很大，深入研究耐鹽性差異的品種在關鍵生育期對鹽預處理的響應機制，對于品種的耐鹽性評價有重要的指導意義[5]。

種子萌發期為研究品種響應鹽脅迫機制的關鍵時期，該階段對植株能否存活和進一步生長發育至關重要[6]。已有研究報道，一定濃度的NaCl預處理可提高鹽敏感種子萌發階段的耐鹽性[7-9]，發芽率和主根長為該時期區分不同品種耐鹽性的重要指標[10]。相比種子，小孢子時期是植物胚胎發育過程中重要的階段[11]，可作為更加理想的脅迫對象。孫月芳等[12]利用NaCl溶液處理大麥小孢子，發現小孢子對外界脅迫刺激極為敏感，存活率明顯受到影響。通過小孢子離體鹽脅迫培養技術，不僅提高了耐鹽材料的篩選效率，而且結合田間鑒定，可快速篩選獲得穩定遺傳的耐鹽純合株系[13]。Liu等[13]對大麥小孢子時期響應鹽脅迫的關鍵基因也進行了研究，發現在連續的鹽脅迫下，細胞防御系統為調控基礎蛋白質合成產生了翻譯抑制，HveIF1A(翻譯起始因子1)和HvRPLP0基因(核糖體蛋白)等下調表達，同時一系列熱休克蛋白基因HvsHSP1和E3泛素連接酶基因HvSIAH1E3等被選擇性地激活，這些基因對小孢子誘導胚性愈傷組織緩解鹽脅迫起著重要作用。前期研究者已證實大麥小孢子培養時期與植株生長發育時期對鹽脅迫的響應具有相關性[14]，但是關于鹽預處理對大麥種子萌發和小孢子愈傷形成的影響效應尚未明確。

本研究以耐鹽性存在差異的2個大麥品種花11和花30為研究對象，探究鹽預處理對品種間種子萌發過程的影響效應在小孢子培養過程中的表現，同時在小孢子時期對2個品種響應鹽脅迫關鍵基因的表達進行研究，旨在為應用小孢子技術鑒定大麥種質資源的耐鹽性提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大麥耐鹽品種花11和鹽敏感品種花30，均由上海市農業科學院植物細胞工程研究室、上海市農業遺傳重點實驗室提供。

1.2 種子萌發期耐鹽性鑒定方法

首先將直徑為9 cm的培養皿清水洗凈后滅菌并烘干，放入2張濾紙待用。其次，選擇飽滿整齊的健康種子，利用3% H2O2消毒8 min后，蒸餾水連續沖洗3次，于30 ℃浸泡于0、5和15 g/L的NaCl溶液，保濕過夜，待種子露白后均勻排放于培養皿的濾紙上，再次加入0、5、10和15 g/L的NaCl溶液處理，并將所有種子置于25 ℃恒溫光照培養箱中發芽。6 d后統計種子的發芽率和主根長度。每個處理共設置3次重復。

1.3 小孢子培養方法

小孢子的游離及培養方法主要參考文獻[15]。選取發育處于單核早中期的大麥穗，先將其置于5 ℃冰箱中預處理17 d，再用飽和漂白粉溶液消毒大麥穗15 min。于每個試管中分別接種10個穗，加入15 mL無菌提取液(60 g/L的甘露醇中添加0.976 g/L 的N-嗎啡乙烷磺酸和1.1 g/L的CaCl2)。利用高速分散器超速旋切，106 μm篩網進行過濾，濾液以700 r/min低速離心5 min，共重復3次，最后收集小孢子。小孢子培養時先將其置于25 ℃黑暗的無菌鹽預處理液中，NaCl溶液質量濃度分別為0、100和300 mg/L，2 d后，將小孢子用無菌提取液和培養基分別洗滌1次，將小孢子密度調節至1.1×105/mL，然后取1 mL小孢子懸浮液于培養皿(20 mm×15 mm)中，Parafilm封口后，置于25 ℃培養箱暗培養。培養至28 d時，稱取愈傷組織的質量并取材、液氮速凍，-80 ℃ 保存。其中，誘導培養基以改良的N6培養基為基本培養基，同時分別添加1.0 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L KT、90 g/L麥芽糖和0、100、200和300mg/L的NaCl溶液。每個實驗共設置4次重復。

1.4 熒光定量PCR檢測

將樣品愈傷組織的RNA通過Trizol Reagent (Invitrogen)提取后，再利用SuperScriptTMⅢ反轉錄酶(Invitrogen)獲得樣品的cDNA[16]。引物序列由北京六合華大基因科技有限公司合成，其中，鹽響應基因的引物序列參考文獻[13]，HvActin和HvGAPDH內參基因的引物序列參考文獻[16]，詳見表1。采用7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystem)對大麥小孢子時期響應鹽脅迫的4個關鍵基因的相對表達量進行分析。定量PCR的總反應體系為20 μL，包括樣品cDNA (約50 ng/μL) 4 μL，正反向引物(10 μmol/L)各2 μL，2×power-up SYBR qPCR Mix (Toyobo) 10 μL和ddH2O 2 μL，反應程序為:95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40個循環[16]。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR

1.5 統計分析

發芽率、主根長和愈傷產量測定結果利用SPSS21.0軟件的Duncan’s新復極差法進行差異顯著性分析；定量PCR的數據根據Chen等[17]的方法計算其基因相對表達量，LinReg軟件分析相關基因引物的擴增效率。

2個品種間愈傷產量的相對比值=同一處理下花30的愈傷產量/花11的愈傷產量；

2個品種間發芽率的相對比值=同一處理下花30的發芽率/花11的發芽率；

2個品種間主根長的相對比值=同一處理下花30的主根長/花11的主根長。

2 結果與分析

2.1 2個大麥品種在種子萌發期對鹽預處理的響應

為了明確2個大麥品種在種子萌發期對鹽預處理的響應差異，以發芽率和主根長作為鑒定指標。在沒有用NaCl預處理種子的情況下，比較2個大麥品種對不同質量濃度鹽脅迫的直接反應(圖1A、D)，結果顯示：在正常萌發條件下，2個大麥品種都能正常發芽，且發芽率無顯著差異，隨著培養基中NaCl質量濃度的提高，花30的發芽率顯著低于花11(圖1A)。在正常萌發條件下，花30的主根長度顯著大于花11；但在鹽脅迫條件下，花30的主根長度與花11無顯著差異，表明花30主根長的抑制程度顯著高于花11(圖1D)。說明，花30在種子萌發期對鹽脅迫的直接耐受性低于花11。種子經過5 g/L NaCl預處理后，在0 g/L鹽脅迫下，花30的發芽率只有30%，而花11的發芽率為66.67%，花30的發芽率相對于花11顯著減少了55%，在5 g/L和10 g/L鹽脅迫下，花11分別具有40%和16.67%的發芽率，花30則完全不能萌發(圖1B)；在5 g/L NaCl預處理后，花30的主根長度也顯著小于花11，在0 g/L鹽脅迫下，花30的主根長相對于花11顯著減少了26.96% (圖1E)；當種子經過15 g/L NaCl預處理時，花30在0和5 g/L鹽脅迫下的萌發率分別為50%和43.33%，發芽率與花11無顯著差異(圖1C)，主根長度也是如此(圖1F)；在10 g/L鹽脅迫下，花30的發芽率和主根長顯著優于花11，分別提高了41.75%和32%(圖1C、F)。說明，花30經過低質量濃度NaCl預處理后，對鹽脅迫的耐受性也低于花11，但是經過高質量濃度(15 g/L)NaCl預處理后，對10 g/L鹽脅迫的耐受性增強，顯著優于花11。

A-C:不同質量濃度的NaCl預處理條件下，2個品種在不同質量濃度NaCl脅迫下的發芽率。其中，A:0 g/L NaCl預處理; B:5 g/L NaCl預處理; C:15 g/L NaCl預處理; D-F：不同質量濃度的NaCl預處理條件下，2個品種在不同質量濃度NaCl脅迫下的主根長。其中，D:0 g/L NaCl預處理; E:5 g/L NaCl預處理; F:15 g/L NaCl預處理。每一柱狀圖上不同字母代表同一性狀在2個品種不同處理間的差異。A-C:The germination rate of the two materials cultured at different salt concentrations with 0 g/L (A),5 g/L (B) and 15 g/L (C) NaCl pretreatment; D-F:The taproot length of the two materials cultured at different salt concentrations with 0 g/L (D),5 g/L (E) and 15 g/L (F) NaCl pretreatment.Different letters on the histogram indicate the significant differences of a trait among different treatments between two cultivars.圖1 2個大麥品種在種子萌發期對鹽脅迫的響應Fig.1 Response of the two barley cultivars to salt stress during the seed germination stage

2.2 2個大麥品種在小孢子培養時期對鹽預處理的響應

為了探索2個大麥品種在小孢子時期對鹽預處理的響應差異，我們對小孢子培養后的愈傷產量進行比較，以愈傷組織產量的高低作為耐鹽性高低的評判指標。在無NaCl預處理的條件下，花30的小孢子在不同質量濃度NaCl培養基上獲得的愈傷產量均小于130 mg/皿,而花11的愈傷產量均大于180 mg/皿，花30的愈傷產量顯著低于花11，表明花30在小孢子時期對鹽的直接耐受性低于花11(圖2A)。經過100 mg/L NaCl預處理后，花30的小孢子在0、100、200和300 mg/L NaCl培養下獲得的愈傷產量均顯著低于花11，表明低質量濃度的NaCl預處理對花30的小孢子造成的損傷很大(圖2-B)；經過300 mg/L NaCl預處理后，花30 的小孢子在不同質量濃度NaCl處理下培養獲得的愈傷產量明顯高于低質量濃度(100 mg/L)NaCl預處理的小孢子，且2個品種的愈傷產量在0、100和200 mg/L NaCl的培養基上均無顯著性差異，但在300 mg/L NaCl的培養基上，花30的愈傷產量顯著超過花11的21.64%(圖2C)，表明，花30小孢子受高質量濃度的NaCl(300 mg/L)預處理誘導后，對高質量濃度的鹽脅迫耐受性增強。

A:0 mg/L NaCl預處理下，2個品種在不同質量濃度鹽脅迫培養下的愈傷產量； B:100 mg/L NaCl預處理下，2個品種在不同質量濃度鹽脅迫培養下的愈傷產量； C:300 mg/L NaCl預處理下，2個品種在不同質量濃度鹽脅迫培養下的愈傷產量。A:Calli yield of the two materials under salt stress with 0 mg/L NaCl pretreatment; B:Calli yield of the two materials under salt stress with 100 mg/L NaCl pretreatment; C:Calli yield of the two materials under salt stress with 300 mg/L NaCl pretreatment.圖2 預處理和培養基中NaCl質量濃度對花11和花30愈傷產量的影響Fig.2 Effect of NaCl concentration in pretreatment and medium on calli yield of H11 and H30

2.3 2個大麥品種在2個時期鹽脅迫下生長指標的相關性分析

通過比較2個供試材料在種子萌發階段與小孢子誘導愈傷階段的發芽率、主根長和愈傷產量的相對比值發現，愈傷產量和發芽率、主根長之間顯著正相關，相關系數分別是0.600和0.648(表2)。

表2 2個大麥品種種子萌發期和小孢子誘導愈傷期相對生長比值的Pearson相關性分析Table 2 Correlation analysis of the relative differences values of germination rate,taproot length and calli yield between two cultivars

2.4 2個大麥品種在小孢子時期響應鹽脅迫的關鍵基因的表達模式

為進一步分析2個品種在小孢子時期響應鹽預處理的分子機制，研究了小熱激蛋白基因HvsHSP1、E3泛素連接酶基因HvSIAH1，核糖體保護蛋白基因HvRPLPO和翻譯起始因子1基因HveIF1A在2個品種中于0和300 mg/L NaCl溶液培養下的表達模式(圖3)。在無NaCl預處理時，2個品種在正常條件和鹽脅迫處理下的HvsHSP1基因表達量均無顯著性差異，但是經過300 mg/L NaCl預處理后，相比0 mg/L培養基，在300 mg/L NaCl培養基下，花11中該基因的表達量顯著減少了97.09%，花30中基因表達量卻顯著增加93.95% (圖3A)；在0 mg/L和300 mg/L NaCl預處理條件下，2個材料之間的HvSIAH1基因表達量在不同NaCl脅迫培養基上均無顯著性差異(圖3B)；HvRPLPO基因在無預處理條件下，于300 mg/L NaCl培養時，花30中基因表達量較花11顯著增加，經過NaCl預處理后，在300 mg/L NaCl培養條件下，該基因在花30的表達量與花11無顯著性差異(圖3C)；HveIF1A基因在無NaCl預處理的條件下，相比0 mg/L培養條件，花30中基因表達量在300 mg/L NaCl脅迫時顯著減少了49.71%，但是在300 mg/L NaCl預處理的條件下，花30中基因表達量較0 mg/L培養條件顯著增加了77.11%，較花11在同樣處理下顯著增加了59.15%(圖3D)。結果表明，經過高質量濃度NaCl預處理后，HvsHSP1和HveIF1A基因可能對于花30緩解高濃度的鹽脅迫起著重要作用。

A: HvsHSP1; B:HvSIAH1; C:HvRPLPO; D:HveIF1A.圖3 2個品種在小孢子時期響應鹽脅迫的關鍵基因的表達模式Fig.3 Expression of the key genes associated with salt tolerance at the microspore culture stage between the two cultivars

3 討 論

植物對逆境的適應與抵抗有多種形式，其中對關鍵發育時期的種子、幼苗或者細胞通過預處理的方式獲得抗逆性是一種最普遍而有效的方式[8]。有研究表明，作物在生長發育的關鍵時期對鹽脅迫預處理的響應是作物應對鹽脅迫的關鍵[6，18]。種子萌發和幼苗建成是植株水平生長發育的關鍵時期，該階段的耐鹽性可以反映植株水平的耐鹽性[14]，而小孢子是減數分裂后四分體釋放出的單核細胞，小孢子時期是高等植物生活史中雄配子體發育過程中重要的階段。有研究表明，在大麥、番茄、苜蓿和大豆等植物中，細胞水平的耐鹽性與植株水平耐鹽性是一致的[19]。本研究結果表明，大麥小孢子誘導愈傷階段與種子萌發階段2個發育時期對NaCl預處理的響應具有顯著的正相關性，花30在直接鹽脅迫或低質量濃度NaCl誘導處理后的耐鹽性低于花11，但是經過高質量濃度(萌發期為15 g/L NaCl，小孢子時期為300 mg/L)NaCl預處理后，花30種子和小孢子的耐鹽性顯著增加，尤其在高質量濃度的鹽脅迫培養時，發芽率、主根長和愈傷產量均顯著優于花11。據此推測，作物品種內在的遺傳基礎決定了不同品種在小孢子誘導愈傷階段或種子萌發階段等關鍵發育時期對NaCl引發或預處理后的響應差異。因此，在小孢子離體培養早期或種子萌發階段實施NaCl鹽脅迫預處理，對于品種的耐鹽性評價具有重要意義。

近年來隨著對植物耐鹽分子機制研究的不斷深入，發現編碼小熱激蛋白的基因在植物逆境脅迫響應等過程中發揮重要功能[20]。Zhao等[21]的研究表明LeHSP21.5基因在番茄中過量表達，轉基因植株對鹽的耐受性顯著增強。Ruibal等[22]報道了在苔蘚中過量表達PpHSP16.4基因能增強植株的耐鹽性。本研究中，經過300 mg/L NaCl預處理后，在鹽脅迫的培養基上，鹽敏感品種中HvsHSP1基因的表達量也顯著增強。該結果與Liu等[13]的研究結果相似，說明，熱休克蛋白作為分子伴侶，參與蛋白質折疊、裝配、易位和退化，它的激活可能對于鹽敏感品種緩解由于鹽脅迫引起的內質網應激以及維持組織細胞的自穩和環境適應性方面起著重要作用。植物的耐鹽性狀為數量性狀，受多基因控制，涉及到多種耐鹽生理生化機制和諸多基因的選擇性差異表達，僅通過對單一的功能基因進行遺傳改良來提高植物的耐鹽性具有非常大的局限性。因此，對基因表達的調控研究十分重要。真核翻譯起始因子1A(eIF1A)是植物中重要的蛋白合成調控因子之一，超表達該基因可明顯增強植物的抗逆性，被認為是鹽脅迫耐受的一個重要決定因素[23]。Liu等[13]也發現轉錄起始因子eIF1A在小孢子細胞應答鹽脅迫中發揮作用。本研究中，HveIF1A基因在無NaCl預處理的條件下，花30中基因表達量在鹽脅迫時顯著減少，但是在300 mg/L預處理的條件下，花30中基因表達量在鹽脅迫時顯著增加，說明鹽脅迫下，花30的翻譯起始受到鹽脅迫的抑制，但是經過NaCl預處理后，翻譯起始能力增強。

本研究揭示不同大麥品種在小孢子鹽脅迫培養過程中對前期鹽預處理的響應能力存在差異，與種子萌發過程對鹽預處理響應能力的差異在某種程度上存在一致性，且發現小孢子經過高質量濃度NaCl預處理后，后期誘導愈傷中HveIF1A和HvsHSP1在受到鹽脅迫時會誘導上調表達，可能與其耐鹽性增強有關，可為進一步利用小孢子培養體系鑒定品種的耐鹽性以及耐鹽性狀遺傳改良提供參考。