大豆與叢枝菌根真菌共生建立及菌根檢測方法的探究

謝麗萍,黃詩宸,許張珂,李友國,林會

農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢430070

叢枝菌根 (arbuscular mycorrhiza，AM) 真菌屬于古老真菌門，可以與80%～90%的高等植物形成互惠共生的關(guān)系[1]。它不僅能改善宿主的營養(yǎng)狀況，尤其是磷營養(yǎng)，同時(shí)也能賦予宿主植物對病原體和非生物脅迫的耐受性[2-3]。隨著AM真菌研究的深入，AM真菌與宿主植物共生的分子機(jī)制已成為菌根研究的熱點(diǎn)。與植物營養(yǎng)生理方面的研究相比，AM真菌與植物共生的分子機(jī)制研究對菌根試驗(yàn)材料的要求更高。一般來說，AM真菌侵染程度越高，共生結(jié)構(gòu)形成越豐富，越有利于共生相關(guān)基因表達(dá)差異的檢測，這就需要建立更適合菌根形成的共生培養(yǎng)體系。

AM真菌屬于專性營養(yǎng)菌，無法純培養(yǎng)，只能通過活體植物對其進(jìn)行繁殖[4]。到目前為止，盆栽培養(yǎng)法仍然是最廣泛和最可靠的菌劑擴(kuò)繁以及菌根實(shí)驗(yàn)的方法[5]。盆栽培養(yǎng)法中，培養(yǎng)基質(zhì)是繁殖菌種和培養(yǎng)宿主的唯一介質(zhì)，是盆栽培養(yǎng)最關(guān)鍵的影響因素。盡管AM真菌可以在不同的培養(yǎng)基質(zhì)中與宿主共生[6]，但理想的培養(yǎng)基質(zhì)可以為AM真菌的生長、侵染和共生提供理想的物理和化學(xué)條件，進(jìn)而促進(jìn)AM真菌的定殖[7]。陳寧等[8]以高粱為宿主，檢測4種不同的培養(yǎng)基質(zhì)對AM真菌(Glomusmosseae93)發(fā)育的影響，證明了沙土混合物(V沙∶V土=3∶1)對高粱的生長和AM真菌(G.mosseae)的生長發(fā)育最為理想。因此，針對不同的宿主植物，選擇合適的盆栽培養(yǎng)基質(zhì)，能更有利于AM真菌的侵染及共生結(jié)構(gòu)的形成，為AM真菌和植物互作的分子機(jī)制研究提供更優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)材料。在眾多與AM真菌共生的植物中，作為世界上最重要的糧食作物和蛋白質(zhì)來源之一的大豆，一直受到學(xué)者的關(guān)注。AM真菌在促進(jìn)大豆共生固氮以及提高大豆地上部分的氮磷積累方面具有顯著的作用[9]。因此，篩選合適的培養(yǎng)基質(zhì)，促進(jìn)大豆與AM真菌共生體系的建立，是AM真菌與大豆共生機(jī)制研究成功的重要基礎(chǔ)。

在AM共生的分子機(jī)制研究中，觀察和測定AM真菌在侵染宿主植物的不同時(shí)期形成的一些特殊結(jié)構(gòu)，如叢枝和泡囊等，能更好地了解AM真菌與植物的共生狀態(tài)[10]。目前，菌根共生狀態(tài)觀察和測定的一般流程為：KOH菌根透明-菌根染色和脫色-菌根制片觀察和統(tǒng)計(jì)。在這個(gè)過程中，不同植物類型及老幼程度不同根段KOH處理的時(shí)間、染色劑的選擇及菌根統(tǒng)計(jì)方法的選擇都會影響菌根的觀察和統(tǒng)計(jì)結(jié)果。如覃曉娟等[11]探討了5種真菌染色劑對香蕉根系 AM 真菌的染色效果，證明5%醋酸墨水染液更適用于香蕉根系真菌的染色和觀察。此外，F(xiàn)üzy等[12]對150多篇涉及宿主根中AM真菌測定方法的論文進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)其中37%、22%和17% 的科學(xué)著作分別采用了網(wǎng)格線相交法[13]、放大網(wǎng)格交叉法[14]和Trouvelot五級分級法[15]，同時(shí)，探討了這3種測定方法的適用范圍，認(rèn)為網(wǎng)格線相交法只適合快速檢測真菌的存在與否，不適合對真菌特征結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)，而其他2種方法都能對這些特殊的結(jié)構(gòu)進(jìn)行估計(jì)。在現(xiàn)今的基因研究方法中，全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)已成為重要的研究方法之一。因此，如何更便捷有效地觀察統(tǒng)計(jì)大批量菌根樣品成為需要解決的首要問題。本研究從培養(yǎng)基質(zhì)和檢測方法的角度入手，以AM真菌Rhizophagusirregularis作為菌劑，檢測不同培養(yǎng)基質(zhì)條件下的AM真菌的共生表型，以期為大豆與AM真菌共生的盆栽培養(yǎng)找到侵染周期短、侵染率高、有利于大豆生長的培養(yǎng)基質(zhì)，同時(shí)探討適合大批量菌根測定，且簡單快速、容易操作及客觀準(zhǔn)確的菌根檢測技術(shù)，為AM真菌與大豆共生互作的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的3個(gè)大豆品種分別是天隆1號(原產(chǎn)地湖北)、冀豆17(原產(chǎn)地為河北)和威廉82(原產(chǎn)地美國)，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

供試AM真菌(R.irregularis)接種劑由農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。該接種劑是以紫云英為宿主擴(kuò)繁10個(gè)月后獲得，接種劑包含AM真菌的孢子、根外菌絲、AM真菌侵染的根段以及根際土壤混合物。每10 g接種菌劑內(nèi)約含(60±3)個(gè)健康有活力的孢子。

盆栽基質(zhì)采用蛭石、土、沙等3種原材料通過不同比例混配獲得，共4種處理：①蛭石；②蛭石-土(V蛭石∶V土=4∶1)；③沙-蛭石(V沙∶V蛭石=1∶1)；④沙-土(V沙∶V土=4∶1)，其中蛭石和沙購自武漢友納生物科技有限公司，土取自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。

1.2 大豆盆栽方法

試驗(yàn)采用雙因素區(qū)組試驗(yàn)，以不同原產(chǎn)地的3個(gè)大豆品種作為宿主，分別種植于4種不同的基質(zhì)中，共設(shè)計(jì)12個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)5次。采用直徑16 cm、高13 cm 的塑料花盆作為培養(yǎng)容器。

種植和接種AM真菌前，提前用巴氏消毒液對培養(yǎng)的溫室、苗床進(jìn)行消毒，所有用到的培養(yǎng)器皿都于121 ℃間歇高壓蒸汽滅菌3次，每次1 h。種子滅菌前，挑選飽滿、均一、健康的大豆種子，并用氯氣滅菌12 h，播種前在超凈臺放置30 min，除掉殘余氯氣。將混合基質(zhì)與AM真菌接種劑按10∶1的比例混合均勻后裝到花盆中，播種。播種完成后，將大豆置于光照培養(yǎng)室(24～28 ℃，16 h光照/8 h暗期)生長。試驗(yàn)期間每周定量澆灌1次低磷Hoagland營養(yǎng)液(磷濃度為20 μmol/L)，每次澆100 mL，其余時(shí)間水分補(bǔ)足，每個(gè)穴盤每次澆水量以穴盤水不向外滲漏為準(zhǔn)。

1.3 樣品收獲及分析測定

取滅菌處理后的混配基質(zhì)樣品100 g，烘箱烘干后測定混合基質(zhì)的理化性質(zhì)。取混合基質(zhì)20 g浸于100 mL去離子水中，3 h后取濾液，測定pH值。將烘干基質(zhì)粉碎，并過孔徑0.5 mm篩網(wǎng)，用H2SO4-H2O2消煮后，使用凱氏定氮法測定氮含量；HClO4-H2SO4消煮后，比色法測定全磷含量；原子吸收光譜法測定鉀含量。

收獲后，先測定植株地上部分和根系總鮮質(zhì)量。再將根系分為兩部分，第一部分樣品用于測定真菌菌根共生指標(biāo)；第二部分根樣與地上部分一同置于60 ℃烘箱中烘干48 h，分別測定干質(zhì)量。

菌根共生指標(biāo)統(tǒng)計(jì)采用放大網(wǎng)格交叉法[14]和Trouvelot[15]五級分級法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS(v25.0)統(tǒng)計(jì)軟件對大豆植株的生物量以及真菌侵染率、叢枝、根菌絲和泡囊等共生指標(biāo)進(jìn)行雙因子方差分析(Two-way ANOVA)，采用LSD法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，使用Origin 9軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)對大豆與叢枝菌根真菌共生的影響

1)培養(yǎng)基質(zhì)的理化性狀。蛭石、蛭石-土(V蛭石∶V土=4∶1)、沙-蛭石(V沙∶V蛭石=1∶1)、沙-土(V沙∶V土=4∶1)4種基質(zhì)的理化性質(zhì)如表1所示，不同基質(zhì)在有機(jī)質(zhì)、總磷、速效磷、速效鉀含量上均有較大差異。其中，蛭石-土中有機(jī)質(zhì)含量最高，其次是沙-土、蛭石，蛭石-沙中最低。總磷含量由高到低依次是蛭石-土、蛭石-沙、沙-土、蛭石。有效磷含量在蛭石-土中最高，其次是沙-土、蛭石，蛭石-沙中最低。速效鉀含量在蛭石-土中最高，其次是蛭石、沙-土，蛭石-沙中最低。4種基質(zhì)的酸堿度相差不大，pH值為6.46～9.29。結(jié)果顯示，4種混合基質(zhì)的營養(yǎng)成分都較貧乏，尤其是有效磷的含量無法滿足大豆正常生長的需要，這可能有助于AM真菌的侵染和共生。

表1 4種基質(zhì)的理化性狀Table 1 Physical and chemical properties of 4 substrates

2)不同基質(zhì)接種AM真菌后大豆生長狀況。將天隆1號、冀豆17和威廉82等3個(gè)品種的大豆分別種植在接種AM真菌的4種基質(zhì)中，觀測其生長狀況。結(jié)果顯示，不同基質(zhì)中大豆的地上部生物量隨著接種時(shí)間的延長而增加(圖1)。在前期(接菌后7、14 d)，不同基質(zhì)中大豆的地上部生物量增加趨勢基本一致。從接菌后21 d開始，不同品種大豆在4種基質(zhì)中地上部生物量開始出現(xiàn)差異。接菌28 d和35 d時(shí)，蛭石-土與沙-土中生長的大豆植株，其地上部生物量都顯著高于其他2種基質(zhì)，相對于沙-土而言，蛭石-土更有利于大豆的生長。大豆的地下部生物量的測定結(jié)果顯示其與地上部分生物量具有相同的變化趨勢。接菌28～35 d，蛭石-土中大豆的地下部生物量顯著高于其他3種基質(zhì)。接菌后35 d時(shí)，沙-土中大豆的地下部生物量也有所增加，并顯著高于其他2種基質(zhì)，但是仍然低于蛭石-土。這表明不同的基質(zhì)處理對于大豆的生長均有顯著的影響，其中，蛭石-土與沙-土這2種基質(zhì)更適合大豆的生長，尤其在蛭石-土中，大豆的長勢更好。此外，不同的大豆品種在不同基質(zhì)中的生長趨勢一致，表明不同處理之間生物量的差異主要是受到培養(yǎng)基質(zhì)的影響。

A：地上部分生物量； B：地下部分生物量； Ⅰ:天隆1號；Ⅱ：冀豆17； Ⅲ:威廉82；不同字母表示組間有差異(P<0.05)，相同字母表示無差異(P>0.05)，誤差線代表5個(gè)獨(dú)立樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差。A:Shoot dry biomass; B:Root dry biomass. Ⅰ：Tianlong 1； Ⅱ：Jidou 17； Ⅲ:William 82; Different letters indicate that there is a difference between the two groups(P<0.05),and the same letter indicates that there is no significant difference between the two groups(P>0.05). The error bars represent the standard deviations of five independent samples.圖1 不同基質(zhì)中大豆生物量的變化Fig.1 Changes of soybean biomass in different substrates

3)不同基質(zhì)中AM真菌的共生表型。AM真菌生長狀態(tài)可以很好地指示共生關(guān)系。AM真菌在4種基質(zhì)中的侵染率隨著接種天數(shù)的延長而增加(圖2)。接菌后7 d，不同基質(zhì)之間的侵染率沒有太大差異。14 d時(shí)，蛭石-土中大豆菌根的侵染率就已經(jīng)顯著高于其他3種基質(zhì)，28 d時(shí)達(dá)到最大值。其他3種基質(zhì)中，AM真菌的侵染率增長趨勢由高到低依次是沙-土、沙-蛭石，在蛭石中侵染最緩慢。從接菌后21 d開始，蛭石-土中大豆菌根的侵染率緩慢增加到最大值，僅有輕微的波動，至35 d時(shí)，4種基質(zhì)中AM真菌的侵染率都達(dá)到最大值(圖2A)。表明培養(yǎng)基質(zhì)能顯著影響AM真菌對大豆的侵染，而蛭石-土更有利于AM真菌的侵染。相比其他3種基質(zhì)，在蛭石-土中AM真菌的侵染周期更短，侵染率在21 d就已接近峰值。

叢枝是AM真菌與宿主植物進(jìn)行營養(yǎng)交換的重要共生結(jié)構(gòu)，它能夠很好地表征宿主與真菌之間營養(yǎng)交換的狀態(tài)。如圖2B所示，隨著接種時(shí)間的延長，蛭石-土中大豆根系皮層細(xì)胞內(nèi)叢枝豐度先明顯增加，并且在接種后 28 d時(shí)出現(xiàn)峰值，而后略有降低。表明在接菌28 d后，蛭石-土中菌根細(xì)胞內(nèi)的叢枝已經(jīng)開始降解。而其他3種基質(zhì)中菌根細(xì)胞內(nèi)的叢枝豐度與蛭石-土中具有一樣的增長趨勢，但在整個(gè)培養(yǎng)期間均顯著低于蛭石-土。

基質(zhì)也對AM真菌根內(nèi)菌絲豐度有影響(圖2C)。不同基質(zhì)中菌根的菌絲量隨著接種時(shí)間的延長而增加，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)基質(zhì)中的菌絲量達(dá)最大值。從接菌后14 d開始，蛭石-土的菌根中菌絲豐度總是高于其他3種基質(zhì)，沙-土的菌根中菌絲豐度僅次于蛭石-土，蛭石與沙-蛭石的菌絲豐度最低。

AM真菌的泡囊豐度也受到基質(zhì)處理的影響(圖2D)。不同基質(zhì)中的泡囊豐度也隨著接種時(shí)間的延長而增加。在AM真菌與宿主大豆剛開始建立共生時(shí)，無泡囊結(jié)構(gòu)，接菌后 14 d時(shí)，開始發(fā)現(xiàn)有少量泡囊形成。與其他3種基質(zhì)相比，蛭石-土中大豆根系的泡囊先于其他3種基質(zhì)出現(xiàn)，而且顯著高于其他3種基質(zhì)，直到培養(yǎng)結(jié)束。其次是沙-土，蛭石與沙-蛭石最低。

A：侵染率； B：叢枝豐度；C：菌絲豐度；D：泡囊豐度；Ⅰ:天隆1號；Ⅱ：冀豆17； Ⅲ:威廉82； 不同字母表示兩組間有差異，相同字母表示無差異，差異在α=0.05的顯著水平，誤差線代表5個(gè)獨(dú)立樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差。A:Percentage root colonization. B:Arbuscule abundance. C:Hyphe abundance. D:Vesicle abundance.Ⅰ：Tianlong 1； Ⅱ：Jidou 17； Ⅲ:William 82; Different letters indicate that there is a difference between the two group,and the same letter indicates that there is no significant difference between the two group,and significant difference at α=0.05.The error bars represent the standard deviations of five independent samples.圖2 不同基質(zhì)對AM真菌共生的影響Fig.2 Effect of different substrates on the growth of AM fungi

綜上，蛭石-土的混合基質(zhì)有利于AM真菌菌絲的生長、延伸，使其更容易侵染大豆根部，形成叢枝和泡囊等共生結(jié)構(gòu)。此外，AM真菌的共生表型在3個(gè)不同的大豆品種之間沒有顯著差異，說明共生表型的差異與大豆品種并無直接相關(guān)性。

2.2 大批量大豆菌根檢測方法的探究

1)不同時(shí)期菌根樣品KOH處理時(shí)間的探索。菌根樣品的透明效果和染色效果是共生指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。菌根的透明效果不理想會導(dǎo)致共生指標(biāo)的錯(cuò)誤判斷，尤其在共生后期，許多共生結(jié)構(gòu)都重疊在一起，最終影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，本研究分別對接種后7、14、21、28、35 d的大豆菌根進(jìn)行了KOH處理時(shí)間的摸索，根據(jù)染色結(jié)果確定了樣品透明效果最佳的處理時(shí)間分別為10、15、30、40、50 min。

2)大豆菌根染色方法的探究。菌根染色效果的好壞也會影響菌根共生指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過比較臺盼藍(lán)和Parker墨水染色方法(圖3)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)臺盼藍(lán)染色的真菌結(jié)構(gòu)染色效果可靠穩(wěn)定，染色樣品不易掉色，可以長期保存，但經(jīng)臺盼藍(lán)染色的根樣，在脫色時(shí)經(jīng)常會出現(xiàn)真菌結(jié)構(gòu)和皮層細(xì)胞的同步脫色，導(dǎo)致根部皮層細(xì)胞被染上與真菌相同或者略淺的顏色，共生結(jié)構(gòu)不明顯，影響真菌結(jié)構(gòu)的觀察與檢測(圖3 A)。采用Parker墨水染色時(shí)，真菌結(jié)構(gòu)著色十分牢固，不會出現(xiàn)同步脫色的現(xiàn)象，而且根中的菌絲、叢枝和泡囊等結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征明顯，易于觀察與統(tǒng)計(jì)(圖3 B)。

A：臺盼蘭染色； B：Parker墨水染色；圖中紅色箭頭指向AM真菌在大豆根部的結(jié)構(gòu)，其中A：叢枝；AP：附著胞；H：菌絲；V：泡囊。A:Trypan blue staining; B:Parker ink staining. The red arrow in the picture points to the structure of AM fungi at the root of soybean. A：Arbuscule; AP：Appressorium; H：Hypha; V：Vesicle.圖3 菌根染色方法的比較Fig.3 Comparison of mycorrhizal staining methods

3)菌根共生指標(biāo)檢測方法的探究。通過2種不同的檢測方法來測定AM真菌在大豆威廉82根中的侵染率、叢枝豐度以及泡囊豐度。如圖4所示，放大網(wǎng)格交叉法與Trouvelot五級分級法統(tǒng)計(jì)的侵染率結(jié)果相似，但是Trouvelot五級分級法的平行樣本之間的標(biāo)準(zhǔn)差在不同基質(zhì)中普遍大于放大網(wǎng)格交叉法 (圖4 B)。叢枝豐度的結(jié)果顯示，Trouvelot五級分級法的統(tǒng)計(jì)結(jié)果比放大網(wǎng)格交叉法的統(tǒng)計(jì)結(jié)果小。同時(shí)，在不同基質(zhì)中，叢枝豐度的標(biāo)準(zhǔn)差也普遍高于放大網(wǎng)格交叉法 (圖4 D)。泡囊豐度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果也相差不大，但平行樣本之間的標(biāo)準(zhǔn)差在4種基質(zhì)中的變化不同 (圖4 F)。總體來看，這2種方法都能準(zhǔn)確地測定真菌結(jié)構(gòu)，但是由于放大網(wǎng)格交叉法測定過程所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)差普遍低于Trouvelot五級分級法，說明放大網(wǎng)格交叉法的統(tǒng)計(jì)值更接近真實(shí)值。

3 討 論

AM真菌與宿主植物共生的建立與培養(yǎng)基質(zhì)的理化性質(zhì)密切相關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，在蛭石-土中，大豆的生物量以及AM真菌的侵染率、叢枝豐度、菌絲豐度和泡囊豐度都是最高的。一般來說，基質(zhì)養(yǎng)分含量過高或者過低都不利于宿主植物與AM真菌共生的建立，尤其是有機(jī)質(zhì)的含量[16]。本研究用到的4種混合基質(zhì)都屬于營養(yǎng)貧乏的基質(zhì)，與其他3種基質(zhì)相比，蛭石-土中有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷的含量都相對較高。該基質(zhì)中大豆的地上和地下部分生物量的顯著增加，說明這種基質(zhì)的養(yǎng)分條件適合大豆的生長。同時(shí)，該基質(zhì)中AM真菌在不同時(shí)期的侵染率均顯著高于其他基質(zhì)，并且能較早地到達(dá)侵染高峰，表明該基質(zhì)更有利于AM真菌的侵染以及叢枝、菌絲和泡囊等共生結(jié)構(gòu)的形成，使得大豆與AM真菌能更早地進(jìn)行營養(yǎng)交換，最終促進(jìn)大豆生長。反之，其他3種基質(zhì)中的養(yǎng)分含量較低，不利于共生體系的建立，尤其是蛭石與沙-蛭石基質(zhì)。盡管蛭石中的營養(yǎng)成分比蛭石-沙中稍高，但是該基質(zhì)中的AM真菌的生長發(fā)育并不好，可能是基質(zhì)的其他因素造成的，比如基質(zhì)的通氣狀況和水分狀況等[17]。總體來看，蛭石-土中AM真菌的侵染速度和生長發(fā)育都高于其他3種基質(zhì)，表明該基質(zhì)有助于AM真菌菌絲延伸侵染以及叢枝形成。此外，蛭石和土這2種材料都容易獲得，質(zhì)地較輕，便于操作。因此，蛭石-土這種基質(zhì)可以作為大豆與AM真菌共生分子機(jī)制研究的最佳盆栽培養(yǎng)基質(zhì)。

A：侵染率； B：A圖中5個(gè)重復(fù)樣本的SD值； C：叢枝豐度；D：C圖中5個(gè)重復(fù)樣本的SD值； E：囊泡豐度； F： E圖中5個(gè)重復(fù)樣本的SD值。A:Percentage root colonization; B:SD values of five repeated samples about A; C:Arbuscule abundance; D:SD values of five repeated samples about C; E:Vesicle abundance; F:SD values of five repeated samples about E.圖4 放大網(wǎng)格交叉法和Trouvelot五級分級法的比較Fig.4 Comparison of the magnified intersections method and the five class of Trouvelot method

在AM共生的分子機(jī)制研究中，AM真菌在宿主根中的狀態(tài)可以很好地指示AM真菌與宿主的共生狀態(tài)和共生時(shí)期[12]。目前，確定共生狀態(tài)最常用的方法是AM真菌與宿主共生的染色根樣品的顯微觀察和統(tǒng)計(jì)[18]。在菌根的顯微觀察中，菌根染色效果對于共生指標(biāo)準(zhǔn)確性的統(tǒng)計(jì)尤為重要。目前菌根染色的染色劑除了墨水之外，其他的幾種染料都被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為可能或者可疑的致癌物[19]。本研究選擇最常用的臺盼蘭染色劑和安全無毒的墨水染色劑進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)臺盼藍(lán)染色的根系皮層組織經(jīng)常會被染上相同而略淺的顏色，使得 AM 真菌的結(jié)構(gòu)與皮層組織顏色反差不大，不利于結(jié)構(gòu)的觀察，這與Phillips等[20]的結(jié)果一致，而且臺盼蘭具有致癌作用，安全性不高。而經(jīng)墨水染色的AM真菌結(jié)構(gòu)著色很深，與背景反差大，染色效果極佳，很少會出現(xiàn)根皮層組織被染色的情況。同時(shí)它還具有操作簡便、毒性小、成本低等特點(diǎn)。該結(jié)果與汪茜等[21]的結(jié)果相似。因此，對于大批量大豆菌根的測定，墨水染色法絕對是一種比較理想的染色方法。它不僅能提供很好的染色效果，而且也是一種比較經(jīng)濟(jì)、安全的染色方法。

在菌根的顯微統(tǒng)計(jì)中，共生指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)方法也是影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果準(zhǔn)確性的一個(gè)重要因素。目前，常用的3種統(tǒng)計(jì)方法中，由于網(wǎng)格線相交法只能檢測真菌的存在與否，不能檢測真菌的特征結(jié)構(gòu)，本研究只對放大網(wǎng)格交叉法和Trouvelot五級分級法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，放大網(wǎng)格線交叉法和Trouvelot五級分級法對于AM真菌侵染率、叢枝豐度和泡囊豐度的最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果相差不大，說明這2種方法都能對根中真菌結(jié)構(gòu)進(jìn)行準(zhǔn)確的估計(jì)。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)放大網(wǎng)格交叉法的標(biāo)準(zhǔn)差普遍低于Trouvelot五級分級法，推測原因可能是：(1)放大網(wǎng)格交叉法的評價(jià)方法比Trouvelot五級分級法更加客觀，對人的主觀依賴性小；(2)放大網(wǎng)格交叉法的統(tǒng)計(jì)樣品比Trouvelot五級分級法多，可能會導(dǎo)致誤差降低。此外，與放大網(wǎng)格交叉法相比，Trouvelot五級分級法對叢枝的測定結(jié)果偏小，這可能是因?yàn)閰仓Y(jié)構(gòu)的外觀并不像孢子和泡囊那樣容易辨別，很難在其他結(jié)構(gòu)之間準(zhǔn)確地區(qū)分出叢枝，所以在快速掃描整條根樣時(shí)，Trouvelot五級分級法不能像放大網(wǎng)格交叉法估計(jì)固定點(diǎn)那樣對所有的叢枝都能進(jìn)行準(zhǔn)確地估計(jì)，最終導(dǎo)致Trouvelot分級法對叢枝的統(tǒng)計(jì)結(jié)果被低估。盡管這2種方法都能對根中真菌結(jié)構(gòu)進(jìn)行準(zhǔn)確地測量，而且花費(fèi)的時(shí)間都相同，但是放大網(wǎng)格交叉法平行樣本之間的標(biāo)準(zhǔn)差普遍低于Trouvelot五級分級法，可以認(rèn)為放大網(wǎng)格交叉法的測定結(jié)果更接近真實(shí)值。因此，對于大批量大豆菌根檢測，放大網(wǎng)格交叉法可以作為一種簡單快速、容易操作且客觀準(zhǔn)確的菌根檢測技術(shù)。