團頭魴TYK2基因的克隆與表達分析

張建，王濟秀，吳曉麗，劉紅

華中農業大學水產學院/農業農村部淡水生物繁育重點實驗室，武漢 430070

Janus激酶/信號轉導與轉錄因子(the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信號通路是由多種細胞因子[1]、干擾素[2]、生長因子[3]和相關分子[4]介導的高度保守的信號通路，其廣泛參與免疫[5]、細胞增殖[6]、生長、分化、遷移和細胞凋亡[7]等過程。JAK/STAT信號通路由3個重要因子組成，包括細胞表面的受體、JAK家族成員和STAT家族成員[8]。JAK激酶是一種非受體型絡氨酸激酶，廣泛存在于哺乳動物、鳥類、昆蟲和魚類[9]，在哺乳動物中，包括JAK1、JAK2、JAK3、TYK2等4個成員[10]。TYK2是JAK家族里第一個被鑒定的成員，被證明在細胞因子轉導過程中起著關鍵作用[11]。TYK2蛋白包含4個不同的蛋白結構域：N端的B41、SH2、假激酶區和C末端的激酶區[12-13]。TYK2被證明對Ⅰ型干擾素介導的通路應答起著重要的作用[14]。在之前的小鼠模型的研究表明，除了Ⅰ型IFN和IL-12外，TYK2還對IL-6信號的轉導也有重要的作用[15-16]。在缺失IFN的人類細胞系中，過表達IFN-a后，在細胞中鑒定出TYK2基因，表明TYK2是Ⅰ型干擾素信號通路的關鍵成分[17]。

目前，關于TYK2的研究涉及的魚類比較少，在大西洋鮭(Salmosalar)中，過表達TYK2增強IFN誘導的Mx基因的轉錄水平[18]；在草魚(Ctenopharyngodonidellus)的CIK細胞中，過表達受體CRFB5能促進TYK2蛋白的磷酸化[19]；用一定濃度的瘦素處理黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)肝臟細胞[20]和矛尾復虎蝦魚(Synechogobiushasta)[21]的肝臟細胞，都能上調細胞中TYK2基因的表達。但關于團頭魴(Megalobramaamblycephala)TYK2的研究尚未見報道。團頭魴是我國重要的淡水經濟養殖魚類。目前，由嗜水氣單胞菌感染引起的細菌性敗血癥是團頭魴主要的病害。 筆者所在研究室在前期進行的團頭魴其他抗病基因[22-23]研究的基礎上，克隆團頭魴的TYK2基因，檢測其在健康團頭魴的組織分布情況和感染嗜水氣單胞菌后免疫相關組織中的表達情況，旨在為深入研究TYK2在團頭魴抗嗜水氣單胞菌感染過程中的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗魚與樣品收集

本試驗所用的團頭魴均購自湖北百容水產良種有限公司。試驗所用幼魚規格為45～55 g，健康成魚的規格為480～520 g。將魚運回華中農業大學水產學院實驗基地暫養2周，待其適應環境后，進行試驗。試驗隨機設置對照組和感染組2個處理，每一處理3個生物學重復。為了確定團頭魴TYK2基因的空間表達模式，分別采取健康團頭魴成魚的心臟、肝臟、脾臟、中腎、頭腎、腦、血液、腸道、肌肉和鰓等10個組織。感染試驗中，用濃度為6.7 ×106cfu/mL嗜水氣單胞菌對試驗魚進行腹腔注射，每尾魚注射100 μL。對照組注射100 μL的磷酸鹽緩沖液。在感染注射后的0、4、12、24、72和120 h分別采集試驗組和對照組的肝臟、脾臟、中腎和腸道組織，每個時間點每個生物學重復取5尾魚。上述所取樣品立即放在液氮中凍存24 h，隨后保存于-80 ℃冰箱待用。

1.2 總RNA的提取及cDNA合成

利用Trizol法提取各組織的總RNA，具體步驟參考Trizol試劑(Invitrogen)說明書。用紫外分光光度計(Nanodrop 2000，美國)測定所提取的RNA濃度，另外用瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的完整度和純度。將所提取的RNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa，日本)試劑盒說明書進行反轉錄，獲得cDNA第一條鏈。

1.3 序列驗證和生物信息學分析

在NCBI數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索獲得斑馬魚TYK2基因的cDNA序列，通過本地Blast從實驗室已有的團頭魴轉錄組中獲取團頭魴TYK2基因的序列，用ORF Finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)分析獲得其ORF序列。用Primer premier 6.0軟件設計特異性引物TYK2-ORF-F/TYK2-ORF-R (表1)，以團頭魴中腎cDNA為模板，通過PCR擴增目的片段，利用DNA快速回收純化試劑盒回收DNA片段，之后將DNA片段和Pet-32a載體在37 ℃水浴中雙酶切過夜，再次利用DNA快速回收純化試劑盒，將上述目的片段和載體回收。取2 μL目的片段和1.5 μL的Pet-32a載體進行過夜(12 h)連接，轉化導入感受態DH5α中，菌液PCR驗證后，送武漢擎科生物公司測序。

序列驗證正確后，通過ORF Finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)預測其氨基酸序列，在線網站(web.expasy.org/protscale)分析其蛋白質的理論分子質量，在線網站SMART(smart.embl-heidelberg.de/smart)預測其蛋白質結構域，用DNAMAN軟件進行TYK2蛋白質的多序列對比。最后，利用MEGA 6構建多個物種的TYK2蛋白質的系統進化樹。

1.4 熒光定量PCR

為了檢測TYK2基因在健康團頭魴成魚中的組織分布情況和嗜水氣單胞菌感染后在免疫相關組織中的表達變化，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法，選擇18S rRNA為內參基因，所用引物見表1。qRT-PCR反應體系為20 μL，包括SYBR混合試劑10 μL、ddH2O 7.4 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA模板1 μL。qRT-PCR程序為：95 ℃預變性5 min，然后95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環。

表1 本研究所用的引物信息Table 1 Primers used in this study

1.5 數據分析

研究中的所有數據均表示為3個獨立試驗樣本的平均值±標準誤，并使用SPSS Statistics 17.0和GraphPad 5.0軟件進行數據分析及做圖。采用單因素方差分析和t檢驗來檢測數據的顯著性，將P<0.05描述為統計學差異顯著，P<0.01描述為統計學差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 團頭魴TYK2的序列分析

經克隆、測序驗證，獲得團頭魴TYK2基因的ORF全長3 489 bp，編碼1 162 個氨基酸，在線網站預測其理論分子質量為131.7 ku，理論等電點為6.86。將團頭魴和斑馬魚、大西洋鮭及人等其他脊椎動物的TYK2的ORF序列與其基因組DNA序列進行比對分析，所對比物種均具有23個外顯子和22個內含子，且相對應的外顯子長度相似，內含子大小則差別較大(圖1)。TYK2蛋白的氨基酸多序列比對結果如圖2所示，團頭魴和鯉(Cyprinuscarpio)相似性最高(85.89%)，其次是草魚(81.85%)和斑馬魚(78.71%)，最低的是小鼠(47.82%)；所有物種TYK2蛋白的磷酸化位點一致，說明其高度保守。TYK2蛋白系統進化分析如圖3，魚類的TYK2聚為一支，其中團頭魴的TYK2和草魚的親緣性最近，其次是鯉、斑馬魚和斑點叉尾鮰，與大黃魚的親緣性最遠；另外，哺乳動物則聚為另外一支。

豎線段表示外顯子，豎線段之間的橫線段表示內含子，豎線段的寬度和橫線段的長度表示核苷酸的長度。The vertical lines represent exons,the horizontal lines between them represent introns,and the width and length of the vertical and horizontal lines represent the length of the nucleotide,respectively.圖1 脊椎動物TYK2基因結構圖Fig.1 The structure of TYK2 genes in vertebrates

2.2 TYK2在健康團頭魴各組織中的表達

通過qRT-PCR檢測TYK2基因在健康團頭魴成魚不同組織中的分布情況，結果如圖4所示。TYK2在中腎中的表達量最高，其次是血液、脾臟和頭腎，在腸道、腦、鰓、心臟、肌肉和肝臟中的表達量較低。

2.3 感染嗜水氣單胞菌后團頭魴TYK2的表達

感染嗜水氣單胞菌后，在團頭魴脾臟中，TYK2的表達在感染后4 h極顯著下調，并達到最小值(0.46倍，P<0.01)；在12 h極顯著上調，并達到最大值(1.78倍，P<0.01)；之后顯著下調。在中腎中，TYK2在感染后24 h極顯著上調，并達到最大值(2.22倍，P<0.01)；在72 h顯著下調并達到最小值(0.26倍，P<0.01)。在腸道中，TYK2在感染后4 h極顯著下調表達，并達到最小值(0.42倍，P<0.01)；在12 h顯著上調，并達到最大值(1.39倍，P<0.05)；在72 h和120 h極顯著下調。TYK2在免疫相關組織中的表達變化表明，它可能在團頭魴感染嗜水氣單胞菌后的免疫過程中發揮著一定的作用。

*間隙用短線表示。所有的氨基酸一致用灰色表示，75%一致用淺灰色表示。方框表示磷酸化位點。*Gaps are indicated by dashes. Identical amion acids are shaded in gray,and the light gray represent 75% similarity.The square marks the phosphorylation site.物種登錄號：草魚 Ctenopharyngodon idella (AMK47892.1)；斑馬魚 Danio rerio (XP_009298018.1)；大西洋鮭 Salmo salar (AGS07436.1)；半滑舌鰨 Cynoglossus semilaevis (XP_024920336.1)；黃顙魚 Tachysurus fulvidraco (ALJ92431.1)；牙鲆Paralichthys olivaceus (XP_019950262.1)；斑點叉尾鮰 Ictalurus punctatus (XP_017310696.1)；大黃魚 Larimichthys crocea (XP_019130882.1)；非洲爪蟾Xenopus laevis (NP_001085663.1)；原雞 Gallus gallus (XP_025001512.1)；小鼠 Mus musculus (AAD49423.1 )；人 Homo sapiens (NP_003322.3 ).圖2 團頭魴和其他脊椎動物TYK2氨基酸多序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of TYK2 from blunt snout bream and other vertebrate species

物種名：草魚 Ctenopharyngodon idella，鯉 Cyprinus carpio，斑馬魚 Danio rerio,斑點叉尾鮰 Ictalurus punctatus，大西洋鮭 Salmo salar，青鳉 Oryzias latipes，大黃魚 Larimichthys crocea，半滑舌鰨 Cynoglossus semilaevis，非洲爪蟾Xenopus laevis，原雞 Gallus gallus，人 Homo sapiens，小鼠 Mus musculus.圖3 脊椎動物TYK2蛋白的系統進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of TYK2 in vertebrates

MK：中腎 Mid-kidney； BL：血液 Blood； S：脾臟 Spleen； HK：頭腎 Head-kidney； I：腸 Intestine； B：腦 Brain； G：鰓 Gill； H：心臟 Heart； M：肌肉 Muscle； L：肝臟 Liver．柱上不同的字母表示顯著性差異(P<0.05)。Different letters above pillar indicate statistically significance (P<0.05).圖4 團頭魴TYK2在健康成魚組織中的相對表達量Fig.4 Relative expression of TYK2 gene in different tissues of healthy adult blunt snout bream

3 討 論

基因結構分析顯示團頭魴TYK2基因由23個外顯子和22個內含子組成，與其他幾種魚類及人等脊椎動物物種的比較發現，不同物種該基因的外顯子和內含子數目相同，對應外顯子的核酸數目也基本一致，但是內含子大小差異顯著，說明TYK2基因在進化中高度保守[24]。該基因編碼1 162個氨基酸，含有4個蛋白質結構域，B41結構域、SH2結構域、假激酶結構域和絡氨酸激酶結構域[25]。經過氨基酸多序列比對分析，這些蛋白結構域在不同物種中具有高度的保守性。已有研究發現，JAK家族蛋白被細胞膜上的受體激活，使JAK家族蛋白位于激酶結構域的磷酸化位點被激活，進而激活下游蛋白[26]。在系統進化分析中，團頭魴首先與草魚聚在一起，然后與其他魚類聚為一支，其他脊椎動物物種則聚為另一支，與其分類地位一致。

健康團頭魴的組織表達結果顯示，TYK2在中腎中的表達量最高，在其他免疫相關組織(脾臟和頭腎)以及血液中表達較高，在其他組織中的表達量比較低。類似的，在其他魚類中，鱖的TYK2在心臟、血液和免疫相關組織(鰓、脾臟、腸、中腎和頭腎)中的表達量較高[26]；在大西洋鮭中，TYK2在脾臟、頭腎和肌肉中高表達[18]；在黃顙魚中，TYK2在中腎、頭腎、脾臟和腸中高表達，而在肌肉中的表達較低[20]；在矛尾復蝦虎魚中，TYK2在腦、心臟和免疫組織(鰓、腸和中腎)中高表達，在肌肉中低表達[21]；有趣的是，鯉TYK2在皮膚中表達最高，其次是腸和血液，在其他免疫相關組織(脾臟、中腎和頭腎)的表達較低，這種表達的差異性可能受魚體自身及其養殖環境的影響[27]。在哺乳動物中，人的TYK2基因在淋巴組織和免疫細胞中大量表達[28]；在鴨的研究中，TYK2在組織中廣泛表達，在心臟和肝臟的表達量較高，在肌肉和胃中的表達量較低[25]。在哺乳動物和魚類中，TYK2均在免疫相關組織中高表達，表明其功能和自身的免疫過程可能有一定的關聯。

*顯著性差異(P<0.05) ； **極顯著性差異(P<0.01)。*Statistical difference (P< 0.05) ； **Extremely statistical difference (P<0.01).圖5 團頭魴TYK2基因在嗜水氣單胞菌感染后的脾臟、中腎和腸道中的表達Fig.5 Relative expression of TYK2 in spleen,mid-kidney and intestine after infection of A. hydrophila in blunt snout bream

TYK2是一種非受體型絡氨酸激酶，不直接參與物種的免疫過程。在物種免疫過程中，細胞因子和細胞受體結合形成三聚體將TYK2磷酸化，TYK2將下游的基因磷酸化，進而作用于免疫相關的基因[9]。

本研究中團頭魴TYK2基因在中腎、脾臟、頭腎和腸的表達量較高，但感染嗜水氣單胞菌后，TYK2在頭腎中的表達沒有顯著性變化，這可能與頭腎的組織特異性或者受到實驗環境影響有關。感染嗜水氣單胞菌后，相對于對照組，團頭魴TYK2基因在脾臟和腸道中均在4 h顯著下降并達最小值，在12 h顯著性上升并達最大值。在中腎中，團頭魴TYK2基因在24 h極顯著性上調并達最大值，在72 h極顯著性下調并達最小值。這說明TYK2在團頭魴抵抗嗜水氣單胞菌的過程中起著重要的作用。在脾臟中，TYK2在24、72和120 h相對于對照組顯著降低，表達恢復穩定。在中腎和腸中，相對于對照組，TYK2達到最大值后，表達仍在變化，說明TYK2可能在腸和中腎的作用時間較長。團頭魴TYK2基因在中腎中的基因表達量最大值的時間點相對于在脾臟和腸的時間點晚一些，說明中腎可能在團頭魴抗嗜水氣單胞菌的過程中，作用時間稍晚。另外，團頭魴TYK2在腸道中的表達趨勢與TYK2在斑點叉尾鮰的腸道中的表達趨勢相似，表達相對于對照降低[29]。TYK2基因在細胞層面的研究較多，例如在缺失IFN的人類細胞系中，過表達IFN-a后，在細胞中鑒定出TYK2基因，表明TYK2是I型干擾素信號通路的關鍵成分[17-18]。在草魚CIK細胞中，過表達受體CRFB5能促進TYK2蛋白的磷酸化[20]。

綜上，本研究克隆獲得團頭魴TYK2基因，其在進化上有較高的保守性。在健康團頭魴中，TYK2在免疫相關組織(中腎、脾臟和頭腎)和血液中的表達量較高；感染嗜水氣單胞菌后，在免疫相關組織(中腎、脾臟和腸)中均有顯著變化。這些結果均說明團頭魴TYK2基因可能在團頭魴抗細菌感染的免疫過程中發揮著重要的作用。