藏花素通過PI3K/Akt信號途徑對阿爾茨海默病細胞模型海馬神經(jīng)元凋亡及P-CREB表達水平的影響

楊 艷，楊愛明，孫 俊，張 征，白 翔

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease， AD)又稱為慢性老年癡呆癥，其發(fā)生與遺傳、機體炎癥感染、鋁中毒、鈣失衡等密切關聯(lián)，主要病理變化為神經(jīng)纖維纏結、神經(jīng)元變性丟失、老年斑沉積，并伴隨彌漫性大腦皮層萎縮[1-2]。AD的發(fā)病機制尚未完全明確，目前β樣淀粉蛋白(Beta-like amyloid， Aβ)級聯(lián)反應已成為主流觀點，即Aβ沉積導致大腦神經(jīng)元變性、缺失，造成AD病人記憶、認識損傷[3]。在AD發(fā)生發(fā)展過程中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號途徑是調(diào)控神經(jīng)元細胞生長、存活的重要通路，一方面可調(diào)控抗凋亡和促凋亡基因的表達抑制細胞凋亡，同時還能促進環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應序列結合蛋白(cAMP responsive element binding protein， CREB)的磷酸化，誘導cAMP反應序列基因表達，維持細胞存活，在神經(jīng)元再生、突觸形成及學習記憶等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用[4-5]。現(xiàn)代藥理學研究表明藏花素可維持神經(jīng)元生存，激活小膠質(zhì)細胞，降低炎性介質(zhì)誘導的神經(jīng)毒性，同時還能破壞早期Aβ聚集及纖維化的形成，發(fā)揮神經(jīng)保護作用改善[6]。但是對其具體作用機制，文獻報道并不多見。Aβ沉積以及tau蛋白磷酸化、老年斑形成、神經(jīng)原纖維纏結是AD的病理學特征。其中Aβ級聯(lián)反應假說核心理論為腦內(nèi)異常沉積的Aβ通過一系列復雜的病理機制導致大腦神經(jīng)元變性、缺失，最終導致認知功能損害是造成AD病人記憶認知損傷的始動因素。Aβ25～35是阿爾茨海默氏淀粉樣蛋白β肽的Aβ(25～35) 片段，可引起神經(jīng)細胞Aβ沉積，顯示出神經(jīng)毒性活性，已經(jīng)廣泛用于AD細胞模型的建立。本實驗應用Aβ25～35處理大鼠海馬神經(jīng)元建立AD細胞模型，探討藏花素發(fā)揮神經(jīng)保護的作用及其具體機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 動物來源：SD大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司， 許可證號SCXK (滬) 2012-0002。試劑耗材：藏花素(純度>95%；批號19042401)購于沈陽藥科大學中藥學院；DMEM培養(yǎng)基(批號：AB10110957)購于Hyclone公司；二甲基亞砜、噻唑藍(MTT)、Aβ25～35購于Sigma公司；乳酸脫氫酶活性檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所；TRIzol試劑盒購于北京華邁科生物技術有限責任公司；DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；HRP標記山羊抗小鼠和抗兔IgG均購于北京博奧森生物技術有限公司。PI3K/Akt信號途徑相關蛋白引物、β-actin引物以及兔抗大鼠PI3K、Akt、Bcl-2、Bax和GAPDH多克隆抗體購于Cell Signalling公司。

儀器：二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國 Forma Scientifis公司)；PVDF膜購于美國Invitrogen公司；流式細胞儀購于美國Becton-Dickinson公司；倒置顯微鏡購于Olympus 公司；熒光顯微鏡購自Life Technologies公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng) SD雄鼠與雌鼠按照1∶1隨機置于交配籠中，待乳鼠出生后24 h，75%乙醇消毒，斷頭處死，于超凈臺分離海馬組織，按照組織∶0.125%胰酶1∶5(V∶V)消化15 min。隨后加入DMEM/F12培養(yǎng)基[含10%磷酸緩沖鹽溶液(FBS)]。2 000目尼龍網(wǎng)過濾，差速貼壁1 h獲取細胞懸液，調(diào)整細胞懸液密度調(diào)整為1×106個/mL。原代海馬神經(jīng)元接種于96孔板，并置于飽和濕度培養(yǎng)箱(37 ℃，5%二氧化碳)中培養(yǎng)，2～3 d更換1次培養(yǎng)液。應用抗GFAP抗體和Neu N抗體進行熒光染色，若結果顯示海馬神經(jīng)元純度超過90%則可進行以下各項實驗操作。

1.2.2 對海馬神經(jīng)元凋亡的影響 將原代海馬神經(jīng)元分為5組，模型組加入Aβ25-35(終濃度10 μmol/L)， 藏花素低、中、高劑量組在模型組基礎上分別加入終濃度為1 μmol/L、3 μmol/L、10 μmol/L[溶劑為二甲基亞砜(DMSO)]的藏花素，正常組則只加入同體積的DMSO，確保體系總DMSO含量低于1%(V/V)。5組細胞置于飽和濕度培養(yǎng)箱(37 ℃，5%二氧化碳)中培養(yǎng)24 h后采用MTT法檢測神經(jīng)元存活分數(shù)，采用TUNEL染色檢測海馬神經(jīng)元凋亡情況。MTT法檢測具體步驟：于24 h向細胞培養(yǎng)板中加入MTT溶液(5 mg/mL，1/10培養(yǎng)液量)，溫孵育4～6 h后除去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入DMSO(350 μL)助溶，振蕩約10 min，于酶標儀上檢測波長為490 nm時的吸光度值(A490 nm)，神經(jīng)元存活分數(shù)=A490 nm(含藥組或模型組)/A490 nm(正常組)×100%，平行5次取平均值。TUNEL染色檢測操作：于24 h取出預先放置在各組神經(jīng)元內(nèi)的小爬片，PBS沖洗3次后采用4%多聚甲醛固定0.5 h，根據(jù)TUNEL原位檢測試劑盒操作步驟進行TUNEL染色，于顯微鏡觀察細胞凋亡情況(細胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒則為凋亡)，隨機取5個互不相干的顯微視野，檢測每個視野凋亡細胞數(shù)。

1.2.3 PI3K/Akt通路相關蛋白以及P-CREB蛋白的表達 采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)測定蛋白表達水平。不同濃度藏花素溶液處理(0μmol、1 μmol、3 μmol、10 μmol)原代海馬神經(jīng)元后，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將待測蛋白液上樣到10% SDS-PAGE凝膠電泳上，對蛋白質(zhì)進行電泳分離，隨即轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶進行封閉，將膜取出，清洗，進行一抗孵育和二抗孵育，溫孵育2 h后，TBST洗滌3次，按照DAB顯色試劑盒說明進行顯色，檢測蛋白質(zhì)條帶，以GAPDH為內(nèi)參，分析各條帶灰度值，計算各相關蛋白(PI3K、Akt、Bcl-2、Bax、P-CREB)與內(nèi)參光密度值的比值，計算平均值以反映蛋白含量。

1.2.4 PI3K/Akt通路相關蛋白以及P-CREB蛋白的mRNA表達 不同濃度藏花素溶液處理(1 μmol、3 μmol、10 μmol)原代海馬神經(jīng)元后，采用TRIzol試劑盒(北京華邁科生物技術有限責任公司)提取總RNA，以5 μL血清總RNA為模板，按TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國GeneCopoeia)說明書要求，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增儀(ABI 公司)并按照Taqman探針試劑盒的要求，以GAPDH mRNA作為內(nèi)參基因，檢測各蛋白 mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 藏花素對海馬神經(jīng)元凋亡的影響 處理7 d后觀察細胞形態(tài)，正常組海馬神經(jīng)元細胞飽滿、密集，延伸出一條長軸突和多條短而密的樹突，細胞聚集生長，軸突、樹突交織成網(wǎng)絡狀。詳見圖1、圖2。模型組、藏花素各劑量組神經(jīng)元存活分數(shù)低于正常組，凋亡細胞數(shù)高于正常組，其中經(jīng)過Aβ25～35處理后，隨著藏花素濃度的增加，神經(jīng)元存活分數(shù)顯著增加，凋亡細胞數(shù)降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

圖1 大鼠原代海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)(×200)

圖2 免疫熒光化學染色法鑒定海馬神經(jīng)元 (×200)

表2 藏花素對海馬神經(jīng)元凋亡的影響 (±s)

2.2 藏花素對PI3K/Akt通路相關蛋白以及P-CREB蛋白表達的影響 模型組、藏花素各劑量組PI3K、Akt、Bcl-2、P-CREB蛋白表達水平低于正常組，而Bax蛋白高于正常組，其中經(jīng)過Aβ25～35處理后，隨著藏花素濃度的增加，PI3K、Akt、Bcl-2、P-CREB表達水平均增加，Bax表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 藏花素對 PI3K/Akt通路相關蛋白以及P-CREB蛋白表達的影響比較 (±s)

2.3 藏花素對各蛋白mRNA水平的影響 模型組、藏花素組PI3K mRNA、Akt mRNA、Bcl-2 mRNA、P-CREB mRNA表達水平低于正常組，而Bax mRNA表達水平高于正常組，其中經(jīng)過Aβ25～35處理后，隨著藏花素濃度的增加，PI3K、Akt、Bcl-2、P-CREB mRNA表達水平均增加，Bax mRNA表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 藏花素對各蛋白mRNA水平的影響比較 (±s)

3 討 論

AD是臨床常見的中樞神經(jīng)退行性病癥，多發(fā)于65歲及以上的老年人群，主要癥狀為認知障礙、記憶力下降、精神行為紊亂等[7]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Aβ沉積以及Tau蛋白異常是AD最有可能的發(fā)病機制，其中大量文獻研究認為Aβ異常聚集在AD發(fā)病過程中至關重要，可導致Tau神經(jīng)元蛋白發(fā)生磷酸化、誘導神經(jīng)元突觸丟失和凋亡等，最終影響認知水平[3，8]。但多年來針對Aβ的大量靶向藥物尚未有通過臨床Ⅲ期試驗的案例，因此，在繼續(xù)積極開發(fā)靶向Aβ藥物的同時進一步探尋Aβ作用機制已成為AD基礎研究的方向。研究發(fā)現(xiàn)藏紅花具有解郁安神、活血化瘀等功效[6]，其在AD防治中的藥效作用已得到臨床認證，藏花素是從藏紅花中提取的活性成分，研究發(fā)現(xiàn)藏花素可調(diào)控PI3K/Akt信號通路，降低H2O2誘導而引起的原代海馬神經(jīng)元氧化應激損傷，最終發(fā)揮抗氧化和細胞凋亡作用[9]。本研究結果顯示，原代海馬神經(jīng)元經(jīng)過Aβ25-35處理后PI3K、Akt蛋白以及mRNA水平降低，而Bax蛋白以及mRNA水平增加，藏花素組中隨著藏花素濃度的增加，各蛋白表達水平改善，證實藏花素可上調(diào)PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表達，而降低Bax表達，激活PI3K/Akt通路，本研究結果與崔勇等[9]研究一致。PI3K/Akt通路一方面可保護細胞膜完整性，防止神經(jīng)元細胞膜上磷脂酰絲氨酸外翻，發(fā)揮抗細胞凋亡作用，另一方面可作用于下游凋亡蛋白，如促進抗凋亡蛋白(Bcl-2)的表達，抑制促凋亡蛋白的表達(Bax)，增高Bcl-2/Bax比值，進一步抑制細胞凋亡[10-11]，故而經(jīng)過藏花素處理后神經(jīng)元存活分數(shù)增加，而凋亡細胞數(shù)降低。

PI3K/Akt通路作為機體重要的胞內(nèi)促細胞存活轉(zhuǎn)導途徑，膜外信號激活PI3K后，可結合于Akt的N末端的PH結構域，使其轉(zhuǎn)移到胞膜上，進而被激活胞膜上的磷脂肌醇依賴的激酶磷酸化，誘導Caspase-9、GSK3β、BAD等底物蛋白的表達，調(diào)節(jié)細胞分化、存活[9-12]。其中Akt可正性調(diào)節(jié)CREB轉(zhuǎn)錄因子，促進P-CREB形成，加快蛋白轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)神經(jīng)元再生、突觸形成以及記憶和學習等生物學行為[5，13]。Bartolotti 等[14]研究顯示AD病人CREB/P-CREB水平與疾病關系密切，隨著疾病嚴重程度的增加，海馬組織中cAMP水平明顯降低，使得CREB/P-CREB水平相應降低。本研究結果顯示原代海馬神經(jīng)元經(jīng)過Aβ25～35處理后P-CREB水平降低，通過加入藏花素后其表達水平增加，且呈現(xiàn)濃度依賴性，表明藏花素可上調(diào)P-CREB表達，進而促進Bcl-2、c-fos等蛋白的表達，抑制Aβ異常聚集，最終抑制細胞凋亡[15]，同時P-CREB還能促進腦源性神經(jīng)生長因子、堿性成纖維細胞生長因子的表達，從而調(diào)控神經(jīng)元應激損傷后的修復、再生等。AD病人海馬的神經(jīng)元大量丟失，Akt水平顯著下降，藏花素通過活化PI3K/Akt通路促進Akt的表達，進而介導多種生物學效應，如促進細胞生長、增殖，調(diào)控血管生成、細胞存活等[6]。Akt作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其水平的增加可促進CREB的磷酸化，使得CREB與對應啟動子區(qū)域相連，進而誘導cAMP反應元件基因的表達，維持細胞存活[5]。Li 等[16]研究發(fā)現(xiàn)P-CREB誘導產(chǎn)生的腦源性神經(jīng)生長因子可進一步激活PI3K/Akt信號通路，加快CREB向P-CREB的轉(zhuǎn)化，拮抗Aβ25～35對原代海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性，最終減少神經(jīng)元凋亡，改善突觸可塑性和AD病人的認知功能障礙。

藏花素可通過調(diào)控PI3K/Akt信號途徑以及促進P-CREB表達，發(fā)揮海馬神經(jīng)元保護作用，抑制細胞凋亡。