耐藥金黃色葡萄球菌感染抗菌藥物替代療法的研究進展

許素琪，李高峰

(湖南師范大學附屬第一醫院 湖南省人民醫院整形激光美容外科,湖南 長沙 410005)

金黃色葡萄球菌是一種革蘭陽性球菌，主要存在于人類的皮膚和呼吸道黏膜等部位。其作為條件致病菌，當機體免疫功能低下或皮膚黏膜出現破損時,可突破皮膚及黏膜屏障，導致皮膚、肺等部位出現感染，重度感染可因出現敗血癥、膿毒癥等致死。近年來，由于臨床上抗菌藥物的廣泛使用，導致耐藥金黃色葡萄球菌產生，對臨床治療帶來嚴峻挑戰。1941年自耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)菌株發現以來[1]，MRSA感染已經遍及全球。萬古霉素作為治療嚴重MRSA感染的首選藥物，盡管目前耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(vancomycin-resistantStaphy-lococcusaureus, VRSA)的分離率較低，但VRSA的出現也不容忽視。因此，尋找針對MRSA的新型替代療法刻不容緩。MRSA是感染創面最常分離的細菌之一[2]，目前對于感染創面常采取抗菌藥物治療方式，如全身應用抗菌藥物或局部使用抗菌劑；然而抗菌藥物的使用可能會導致新型耐藥菌的產生，局部使用抗菌藥物對感染創面的微生物是非選擇性的殺滅，并且可能會破壞創面肉芽組織形成和上皮化。此外，包括MRSA在內的大多數細菌的生物膜可以阻止抗菌藥物作用靶部位[3]。針對這些問題許多替代抗菌藥物的療法應運而生。本文對近幾年來可能替代抗菌藥物的療法進行綜述，以期對減少細菌耐藥提供幫助。

1 抗生物膜活性的制劑

1.1 生物表面活性劑 生物表面活性劑(biosurfactant, BS)是由特定的細菌、真菌和酵母產生的兩親性化合物，以銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白假絲酵母菌和醋酸鈣不動桿菌為優勢菌種[4]。按照分子量的不同，可以分為低分子生物表面活性劑(如糖脂、脂肽和磷脂)和高分子生物表面活性劑(如脂蛋白、脂多糖、復合生物聚合物等)[5]。BS是一種天然的綠色產物，由于其可降解性和無毒性，在農業、化工業等方面被廣泛研究和應用[6]。BS表現出抗細菌、真菌和病毒的活性，成為對抗局部感染的合理選擇[7]。BS還具有抗黏附性和抗生物膜性[8]，因此，BS具有替代抗菌藥物療法的潛力。有學者從不同的菌種發現了不同類型對MRSA和多重耐藥金黃色葡萄球菌(MDR-SA)具有抗菌活性的BS[9-10]。Giordani等[11]通過體外試驗發現加氏乳桿菌BC9中分離的BS對MRSA具有抑制作用，不但可以清除MRSA形成的生物被膜，還可以干擾其生物被膜形成。該研究同時發現與單獨使用BS相比，以脂質體為載體形成的生物表面活性劑-脂質體(BS-LP)對生物膜的分散性更強。由于該研究未進行動物試驗，所得結果有待進一步研究證實。盡管BS具有替代抗菌藥物的潛力，但其主要產生者如假單胞菌和芽孢桿菌等具有潛在的致病性，限制了其使用。因此，開發更多的益生菌或非致病菌產生的BS在今后的研究中顯得尤為重要。

1.2 磁性納米顆粒 磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles, MNPs)是近年來發展迅速且具有很大應用價值的新型材料，在磁共振成像、熱療和藥物輸送等生物醫學方面具有獨特優勢。其中基于氧化鐵的納米顆粒(Fe3O4和γ-Fe2O3)具有生物相容性良好、細胞毒性低、合成簡單等優點，在生物醫學研究中廣泛應用。MNPs具有磁導向性，能夠在外加磁場作用下，實現定向移動并傳遞到靶標區域[12]。Li等[13]發現磁性氧化鐵納米顆粒在磁場作用下可以靶向破壞MRSA的生物膜。生物膜的一個主要特征是產生胞外聚合物(EPS)，EPS起到了自身保護屏障作用，能夠防止殺菌劑的滲透。而MNPs可以在磁場的作用下機械破壞EPS基質并導致其脫落，從而使生物膜分散。Nickel等[14]認為雖然MNPs在去除生物膜方面非常有效，但不適合單獨使用；將殺菌劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)與氧化鐵納米顆粒結合，在磁場作用下，負載殺菌劑的磁性納米顆粒可以破壞生物膜基質，達到去除MRSA生物膜的效果；該研究還發現納米顆粒表面電荷密度越高，其殺菌劑的載量更大。Rodrigues等[15]研究發現使用磁熱療還可以進一步破壞生物膜。因此，MNPs在重復使用的醫療設備消毒方面具有很大的應用前景。

1.3 噬菌體裂解酶 噬菌體是一種病毒，能夠感染細菌并在細菌細胞內復制直至細菌死亡。噬菌體裂解酶是噬菌體產生的一系列內溶素酶和病毒粒子相關肽聚糖水解酶的統稱，其具有降解細菌肽聚糖的潛力。有大量體外和體內試驗證明噬菌體裂解酶能夠抑制金黃色葡萄球菌，包括MRSA菌株在內。相比傳統抗菌藥物，噬菌體裂解酶具有以下優點：(1)具有高度的種屬特異性；(2)能夠有效破壞金黃色葡萄球菌的生物膜[16]；(3)能夠抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成[17]；(4)不易產生耐藥性[18]。雖然市場上目前只有一種人類使用的治療金黃色葡萄球菌(包括MRSA)感染的裂解酶產品-Staphefekt，主要適用于皮膚感染的早期階段，能夠改善濕疹、痤瘡的炎癥反應[19]。但是，目前很多公司已經致力于研發不同噬菌體裂解酶產品,有些已經進入人體試驗階段。其中，用于治療金黃色葡萄球菌血流感染的裂解酶CF-301已進入二期臨床階段[20]。Cheng等[21]將裂解酶LysGH15和芹菜素(apigenin,API)制成軟膏作用于MRSA感染的小鼠皮膚傷口模型中，結果顯示傷口細菌數量減少，并降低了促炎細胞因子(腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β和干擾素-γ)的水平，加速傷口的愈合。裂解酶對于治療MRSA感染具有巨大潛力，需不斷探索不同種類的裂解酶或裂解酶與不同種類的殺菌劑組合后對MRSA的殺菌作用，探索最優組合和最佳給藥方式，評估其安全性及進行藥物代謝動力學相關試驗。

1.4 細菌素 細菌素是由細菌通過核糖體途徑合成的初級微生物產物，為帶正電荷高度疏水的蛋白類物質，細菌素能夠有效地滲透生物膜，對于可以形成生物膜的病原體有一定的殺傷作用[22]。與抗菌藥物的抗菌特性相比，細菌素的抑菌譜較窄，具有一定的專一性和靶向性，不容易產生耐藥。近年來不同種類的細菌素被發現并通過體外試驗證明了其對MRSA的抗菌作用，如枯草芽孢桿菌ib17產生的細菌素(bac_ib17)、芽孢桿菌TSH58產生的細菌素BLIS、巴氏葡萄球菌RSP-1產生的一種新型細菌素-巴氏菌素[23-25]。O’sullivan等[26]從人體7個部位分離的細菌共產生21種細菌素，分別表現出從寬到窄的抑菌譜，能抑制革蘭陽性菌的生長，包括皮膚表面機會致病菌，如痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌和MRSA。乳酸菌產生的細菌素由于其安全性和無毒性一直是許多研究的重點，乳酸鏈球菌產生的Nisin細菌素是目前唯一商業生產的細菌素，作為食物防腐劑使用，其在生物醫學方面具有較大的開發潛力。Nisin被證明能有效應用于金黃色葡萄球菌感染動物模型的治療[27]。實驗室研究證明含Nisin的創面敷料可以顯著減少金黃色葡萄球菌的定植并促進傷口愈合[28]。因此，Nisin在MRSA感染創面中的應用值得進一步研究。

1.5 組蛋白 組蛋白是一種真核生物體細胞染色質與原核細胞中的堿性蛋白質，其與DNA共同組成核小體結構。然而，組蛋白也可在細胞核外發現，組蛋白由中性粒細胞釋放，是抵御細菌感染的天然防御系統的一部分[29]。組蛋白具有很強的抗菌活性，主要由于其具有類似陽離子抗菌肽的特性。組蛋白可分為富賴氨酸組蛋白(H1、H2A和H2B)和富精氨酸組蛋白(H3和H4)，H2A、H3和H4已被證明具有抗金黃色葡萄球菌活性[30]。Pietrocola等[31]研究發現H3為最有效的抗金黃色葡萄球菌組蛋白。H5組蛋白是魚類、兩棲類和鳥類的有核紅細胞中存在的特殊類型組蛋白。Rose-Martel等[32]研究發現從雞紅細胞中提取和純化的組蛋白H5對MRSA具有抗菌活性和抗生物膜活性，其作用機制可能與生物膜中的細菌膜被損傷有關。研究發現組蛋白H5相對組蛋白混合物的抗菌活性更強。這些研究結果表明組蛋白和組蛋白類衍生物有望成為針對耐藥金黃色葡萄球菌及其生物膜的替代療法，但仍需要進一步的研究來評估。

1.6 溶血磷脂酸膽堿 溶血磷脂酸膽堿(lysophosphatidylcholine,LPC)，又稱溶血卵磷脂，是真核細胞磷脂的組成部分，由磷脂酰膽堿在哺乳動物肝臟中通過磷脂酶A2水解合成。既往研究認為LPC是一種免疫調節劑，具有炎癥調控作用，其直接抗菌作用報道較少。近期Miyazaki等[33]通過體外試驗發現LPC對大多數MRSA的生長有抑制作用，通過與細胞膜相互作用，誘導細胞膜去極化，增加其通透性，直接誘導殺傷MRSA。但少數MRSA菌株表現出較高的LPC抗性。該研究還發現LPC與慶大霉素具有協同作用，其對皮膚毒性相對較低，可以作為治療MRSA皮膚感染的局部外用藥。但是，LPC具體的殺菌機制需要進一步深入研究。

1.7 植物精油 植物精油(essential oil,EO)是一種可以從植物的不同部位提取的具有揮發性的天然液體。很久以前人們就發現了植物精油的抗菌特性，但是由于抗菌藥物一直占據抗感染治療的主導地位，直到20世紀90年代EO的抗菌作用才開始被廣泛研究。近年來，耐藥金黃色葡萄球菌的傳播增加了人們對EO的關注。本世紀以來，EO對抗MRSA活性的研究逐漸增多。Zouhir等[34]建立了一個關于抗金黃色葡萄球菌和MRSA的植物精油數據庫，共包含287種EOs，其中有177種對MRSA有抑制作用。然而，由于EOs具有水溶性低、化學性質不穩定、光不穩定、熱敏性和揮發性，阻礙了其作為抗菌劑的應用。Perez等[35]將百里香精油制成納米微囊制劑，可以保護精油成分并潛在地提高其抗菌和抗MRSA生物膜活性。Kwiatkowski等[36]發現薰衣草精油能夠增強鹽酸奧替尼啶對MRSA的敏感性，說明EOs與抗菌藥物具有協同性。EOs還可以促進傷口愈合。Manzuoerh等[2]將外用蒔蘿精油軟膏作用于MRSA感染的小鼠創面，發現可以顯著減少炎癥反應并促進傷口愈合，其作用機制可能是通過增加p53和caspases-3的表達以減輕炎癥反應。通過上調B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)的表達來啟動增殖期，并通過提高人雌激素受體α(estrogen receptor alpha, ERα)的表達水平上調膠原生物合成。因此，EOs有潛力成為MRSA皮膚創面感染的局部用藥物。然而，目前具有抗MRSA活性不同植物來源的EOs的抑菌效果有待進一步的對比研究以及體內試驗評估。植物EOs的抑菌活性成分以及抑菌機制方面還需進一步的探索和研究。

2 抗微生物光動力療法

抗微生物光動力療法(antimicrobial photodynamic therapy,aPDT)是一種殺滅病原微生物及其耐藥菌株的新方法，由光敏無毒染料光致敏劑和可激活ps的適當波長的無害光組成。其基本原理為ps作用于感染組織并被細菌、真菌、病毒等病原微生物吸收、聚集，將靶區暴露在適當波段的光照下，從而激活光致敏劑，使其與底物相互作用，誘導氧化損傷的形成[37]。目前，有許多研究證明aPDT對MRSA有殺滅和抑制作用，且不斷有新的光敏劑被發現。近年來已有許多針對光敏劑(包括吩噻嗪、植酸青苷、金絲桃素、氯和卟啉)對MRSA的光滅活效應的研究。最新的進展中，Tash等[38]發現，使用陽離子卟啉衍生物作為光敏劑進行抗菌光動力療法對耐藥金黃色葡萄球菌具有強大的抗菌效果。該研究使用了具有不同抗菌藥物耐藥譜的MRSA臨床分離株作為研究對象。以新合成的陽離子卟啉衍生物(PM，PE，PPN和PPL)為光敏劑，655 nm半導體激光器為光源，通過優化能量劑量和光敏劑濃度進行光滅活試驗。研究發現在不同能量密度和光敏劑濃度的光滅活試驗中，細菌細胞活力下降了99%以上，并且隨著能量劑量的增加，光滅活效率也隨之增加。丁濤等[39]通過體外試驗發現將姜黃素作為光敏劑介導的光動力療法對MRSA及其生物膜具有殺傷作用，并且具有濃度依賴性。Gao等[40]發現了一種新型酞菁光敏劑(ZnPc+)對浮游金黃色葡萄球菌和生物膜形式的金黃色葡萄球菌的抑菌性能，金黃色葡萄球菌對ZnPc+的吸收強度在15 min達到峰值。研究顯示aPDT可促進ZnPc+產生活性氧，導致細胞膜和DNA損傷，并使生物膜受損。Zolfaghari等[41]使用亞甲藍作為光敏劑，結合了670 nm激光應用于MRSA感染小鼠創傷模型，研究結果顯示細菌數量明顯減少。Dai等[42]應用光敏劑(聚乙烯亞胺-ce6)結合光療應用于小鼠局部皮膚感染金黃色葡萄球菌創面，發現傷口愈合的時間明顯縮短。抗微生物光動力療法已被批準用于血液制品的病毒和細菌滅活，但在皮膚感染性疾病方面還處于臨床前研究階段。光敏劑的發展是關鍵因素，如何選擇合適的光敏劑以及光源都需要深入的研究。

3 免疫調節劑

瑞香素(7,8二羥基香豆素，daphnetin,DAPH)是從瑞香植物中分離獲得的一種天然香豆素衍生物，瑞香素具有多種生物學活性，臨床上用于治療各種炎性疾病，如血栓閉塞性脈管炎、類風濕性關節炎和凝血障礙等。平板劃線抑菌試驗已證明瑞香素能抑制金黃色葡萄球菌生長，被列為具有抗微生物活性的化合物之一，但其作用機制尚不明確。DAPH是免疫和炎癥反應的有效調節因子。Zhang等[43]通過動物試驗證明DAPH對MRSA引起的肺部炎癥和損傷具有保護作用，DAPH預處理組的小鼠肺泡損傷和炎癥表現明顯減輕，間質水腫和碎片沉積減輕，炎性細胞浸潤減少，肺組織化程度增加。該研究首次報道了瑞香素的抑菌機制可能是通過促進mTOR依賴的細胞自噬途徑，在抑制炎癥反應的同時，顯著增強巨噬細胞的殺菌活性。免疫調節劑的開發為新的抗微生物療法，特別是針對頑固病原體，如MRSA的治療提供了新的思路。

4 展望

近幾年致病菌對傳統的抗菌藥物已經逐漸產生耐藥性，因此，探索新的作用靶點，開發新的治療機制的抗菌藥物，將是解決金黃色葡萄球菌耐藥的出路。同時，具有抗生物膜活性和免疫調節的新型療法的研究也成為該領域的研究熱點和重點。