生防菌解淀粉芽孢桿菌B15發酵液抗菌譜及安全性測試

張鳳杰 金瑋鋆 張曉蒙 于佳俊 鄒理 孫寶勝 閆寅卓 薛潔

摘要：解淀粉芽孢桿菌B15是來源于釀酒葡萄表面的生防菌，通過研究該菌株發酵液對23種植物病原菌的抑制效果，并以水稻為試驗對象進行安全性測試。結果表明，生防菌解淀粉芽孢桿菌B15的發酵稀釋液（濃度為 10 CFU/mL）對23種植物病原菌的抑制率均在50%以上，對香菇爛筒病、蘋果腐爛病、棉花炭疽病、花生褐斑病和黃瓜枯萎病5種病原真菌的抑制率在90%以上，計算可得EC50的范圍為0.000～11.704 個/mL，表明解淀粉芽孢桿菌B15具有廣譜抗菌性。通過室內田間安全測試試驗，驗證了該菌株對作物的安全性，從而為該菌株生物農藥的開發與應用提供數據支持。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;植物病原菌;抑制率;抗菌譜;安全性測試

中圖分類號： TQ458;S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）05-0102-05

筆者所在實驗室在前期的研究中，從釀酒葡萄表面篩選、鑒定發現1株具有明顯抑制霉菌效果的解淀粉芽孢桿菌（Bacillm amyloliquefaciens），將其編號為B15，并對其抑菌活性成分和代謝機制進行研究。解淀粉芽孢桿菌為學界公認的植物病原真菌的生防細菌，能夠產生脂肽類抑菌物質，并且分裂繁殖速度快、對營養條件要求簡單，因而被廣泛應用于植物疫病防治和果蔬保鮮中，是經美國食品和藥物管理局（FDA）安全認證的菌種，也是國內農業農村部批準的生物農藥使用菌種之一。據統計，以芽孢桿菌為基礎的產品約占細菌生物防治劑產品的一半[7]。

目前，國內研究者分離、研究并進行初步應用的解淀粉芽孢桿菌菌株有YN-1（來源于鄭州果園）[8]、TB-2（來源于茄科作物內生菌）、PEBA20（來源于楊樹內生菌）、HN-06（來源于土壤）等，發現解淀粉芽孢桿菌能夠抑制蘋果炭疽病、蘋果輪紋病、蘋果腐爛病、芹菜菌核病、香蕉軸腐病、桃褐腐病、煙草黑脛病、辣椒疫霉、番茄灰霉等病原菌的生長，并且應用芽孢桿菌處理在防病穩定性與化學農藥的相容性等方面具有明顯優勢[15]。

本研究分析來源于釀酒葡萄表面的解淀粉芽孢桿菌B15的抗菌譜和安全性，旨在為將該菌株作為生防菌開發生物農藥提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻品種為明恢86、武育粳3號、沈農265。

生防菌菌株解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）B15來源于釀酒葡萄表皮，貯藏于國家級酒類品質與安全國際聯合研究中心。23種植物病原見表1，來源于中國農業科學院植物保護研究所農業部農藥化學與應用技術重點開放實驗室。

1.2 培養基

種子液活化培養基為營養肉湯（NB），病原菌活化培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）。基礎發酵培養基為改良Landy培養基，配方如下：30 g/L 葡萄糖，14 g/L谷氨酸鈉，0.5 g/L MgSO4，05 g/L KCl，1.0 g/L KH2PO4，0.15 mg/L FeSO4，50 mg/L MnSO4，0.16 mg/L CuSO4，pH值為7.0。

1.3 菌株B15發酵液的制備

將保存于4 ℃的解淀粉芽孢桿菌B15接種到斜面上，于30 ℃培養48 h，再將其接種于NB培養基上， 于37 ℃、 120 r/min 振蕩培養24 h后進行活化擴培，得到種子液。將種子液按4%的接種量接種于改良Landy培養基中，于30 ℃、180 r/min條件振蕩培養50 h，得到發酵液，然后將發酵液于 8 000 r/min 離心15 min，取上清液。

1.4 抗菌譜的室內生測方法

1.4.1 植物病原菌的活化 用打孔器在實驗室保存的23種植物病原菌平板上取1塊菌板，置于PDA平板中央，放入培養箱中于25 ℃進行培養，待病原菌即將鋪滿平板時取出，用封口膜封好后放入4 ℃冰箱中備用。

1.4.2 發酵液的稀釋 經測定，“1.3”節制備的發酵液的孢子數為1.9×108個/mL，按梯度稀釋為7個濃度（分別為150.0、50.0、25.0、10.0、5.0、1.0、0.5個/mL）的稀釋液試驗組，分別取100 μL稀釋液加入60 mL PDA培養基中，平均倒3個平板，以無菌水作為對照組（即不添加解淀粉芽孢桿菌B15菌液的PDA平板），備用。

1.4.3 菌絲生長速率的測定 參照NY/T 1156.2—2006《農藥室內生物測定試驗準則 殺菌劑 第2部分：抑制病原真菌菌絲生長試驗 平皿法》，將培養好的病原菌在無菌操作條件下用直徑為 7 mm 的滅菌打孔器自菌落邊緣切取菌苔（約 6 mm），將菌絲面向下接種在上述平板中央，25 ℃恒溫培養，待空白對照平板中的菌落充分生長后，用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，計算抑制率，計算公式如下：

菌落增長直徑=菌落直徑平均值-菌餅直徑;（1）

菌絲生長抑制率=對照菌落增長直徑-處理菌落增長直徑對照菌落增長直徑×100%。（2）

采用回歸分析法對試驗數據進行分析，以各處理濃度的對數值為橫坐標、以菌絲生長抑制率換算成的概率值為縱坐標，求出回歸方程和有效抑制濃度（EC50、EC90）。

1.5 安全性測試方法

測試試驗在中國農業科學院植物保護研究所溫室內進行，澆透水后均勻撒播種子，溫室白天溫度為28 ℃，夜間溫度為25 ℃，培育1周后進行施藥。

測定“1.3”節制備的發酵液孢子數，按梯度稀釋為3個濃度（150、50、10個/mL）的稀釋液試驗組，以無菌水作為空白對照組，每個設濃度3個處理，每個處理設10株。采用Spraying System公司生產的氣力噴頭Air Atom噴霧，噴霧壓力0.2 MPa。

施藥后7 d通過目測法觀察各處理水稻的生長情況，觀察水稻是否有變色、壞死、萎蔫等藥害癥狀，從而判斷不同濃度解淀粉芽孢桿菌發酵液對水稻苗的藥害情況。

藥害分級標準（分5級）：-表示無癥狀;+表示新葉上有少量藥斑;++表示新葉上有較多藥斑，但生長基本正常;+++表示新葉畸形扭曲且少量脫落，或花蕾少量脫落，或幼果上有明顯藥斑;++++表示花蕾大量脫落，甚至新梢枯死，或花蕾大量脫落，或果實嚴重受害致畸、脫落。

測量各處理水稻的株高、根長和鮮質量，計算不同濃度菌株B15發酵液噴霧對水稻生長的影響。試驗中的數據采用DPS統計軟件處理，采用Duncans法比較不同處理之間水稻株高、根長和鮮質量之間的差異顯著性。相關公式如下：

株高（鮮質量、根長）抑制率=（CK水稻的株高、鮮質量、根長-處理組的株高、鮮質量、根長）/CK水稻的株高、鮮質量、根長×100%。

2 結果與分析

2.1 B15發酵液抗菌譜的測定

部分室內生物活性測定試驗結果見圖1，其中第1個平板中的CK為空白對照，不添加解淀粉芽孢桿菌B15發酵液，其余各平板為不同稀釋濃度的解淀粉芽孢桿菌B15菌液。試驗結果表明，病原菌在CK平板中的長勢良好，而在添加B15菌液平板中的生長受到明顯抑制，生長直徑與菌液濃度成反比。

以棉花枯萎病病菌為例，生長5 d時，測定不同濃度發酵液處理組的菌落增長直徑，從而計算抑制率（表2），按照“濃度-對數值”和“抑制率-概率值”進行直線回歸分析（圖2），計算得出，EC50為 0.086個/mL，95%置信限為0.056～0.133個/mL，EC90為24.29個/mL，95%置信限為19.54～30.20個/mL。

采用“1.4”節的室內生測方法測定解淀粉芽孢桿菌B15發酵液的抗菌譜，結果（表3）表明，該菌株 10 CFU/mL 稀釋發酵液對供試23種植物病原真菌的抑制率達到50%以上，其中對香菇爛筒病、蘋果腐爛病、棉花炭疽病、花生褐斑病和黃瓜枯萎病5種病原真菌的抑制率在90%以上。由此可見，解淀粉芽孢桿菌B15發酵液的抑菌范圍較廣。

2.2 安全性試驗

噴霧處理后7 d通過目測法觀察藥害情況。由表4可以看出，3種水稻均生長正常，葉色鮮綠，無壞死斑，葉緣無枯黃狀，且無藥害產生。

測定每個水稻品種、每個處理（10株水稻）的株高、根長和鮮質量。由表5可以看出，各濃度解淀粉芽孢桿菌B15對明恢86株高的影響無論在0.05水平還是在0.01水平都沒有顯著差異，而對武育粳3號品種水稻的影響有顯著差異。

由表6可以看出，各濃度的解淀粉芽孢桿菌B15對明恢86、武育粳3號2個水稻品種的根長無論在0.05水平還是在0.01水平都沒有顯著影響。在對沈農265根長的影響方面，各濃度與CK間在0.01水平上有顯著差異，而各濃度之間不具有顯著差異。

由表7可以看出，各濃度解淀粉芽孢桿菌B15對武育粳3號2個水稻品種鮮質量的影響無論在005水平還是在0.01水平都沒有顯著影響。而在對沈農265的水稻鮮質量方面，50、150 CFU/mL處理與CK在0.05水平上具有顯著差異;在001水平上，各解淀粉芽孢桿菌B15濃度與CK及其他各濃度之間都沒有顯著差異。

3 討論與結論

本研究以解淀粉芽孢桿菌B15為研究對象，進行室內生物活性測定和安全性測定， 旨在為將該生防菌株作為生物農藥推廣應用奠定研究基礎。研究結果表明，解淀粉芽孢桿菌B15對23種供試植物病原菌均有抑制作用，且抑制率高，作用濃度低，同時對測試水稻植株無藥害作用，安全性高。以本研究為基礎，可以進行解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑的開發與田間應用研究。

參考文獻：

[1]龔谷迪，周廣田，郭 陽，等. 脂肽surfactin、iturin、fengycin性質鑒定的研究與展望. 中國食品添加劑，2013（3）：211-215.

[2]朱弘元，康 健，范 昕，等. 解淀粉芽孢桿菌B15產脂肽的分離鑒定及抑菌機理. 江蘇農業科學，2016，44（5）：186-189.

[3]潘虹余，金瑋鋆，張曉蒙，等. 解淀粉芽孢桿菌B15抑菌物質對葡萄灰霉病灰葡萄孢的抑菌機理. 微生物學報，2018，58（7）：1245-1254

[4]林 毅，陳金輝，黃志鵬. 芽孢桿菌幾丁質酶及其在植物病蟲害生物防治中的應用. 福建農業科技，1998（增刊1）： 32-33.

[5]Vitullo D，Pietro A D，Romano A，et al. Role of new bacterial surfactins in the antifungal interaction between Bacillus amyloliquefaciensand Fusarium oxysporum. Plant Pathology，2012，61（4）：689-699.

[6]Reva O N，Dixelius C，Meijer J，et al. Taxonomic characterization and plant colonizing abilities of some bacteria related to Bacillus amyloliquefaciensand Bacillus subtilis. FEMS Microbiology Ecology，2004，48（2）：249-259.

[7]Fravel D R. Commercialization and implementation of biocontrol. Annual Review of Phytopathology 2005，43：A337-359.

[8]鄧建良. 解淀粉芽孢桿菌YN-1抑制植物病原真菌活性物質研究. 武漢：華中農業大學，2009：1.

[9]邱思鑫，阮宏春，宋美仙，等. 內生解淀粉芽孢桿菌TB2菌株活性物質誘導辣椒果抗疫病的生化機理. 熱帶作物學報，2010，31（10）：1813-1820.

[10]邱思鑫，何 紅，阮宏椿，等. 內生芽孢桿菌TB2防治辣椒疫病效果及其機理初探. 植物病理學報，2004（2）：173-179.

[11]胥麗娜. 楊樹內生細菌的分離、多樣性分析及解淀粉芽孢桿菌PEBA20的抑菌活性研究. 泰安：山東農業大學，2009：16-21.

[12]李祥英，張英華，胥麗娜，等. 解淀粉芽孢桿菌對煙草葉片光合特性的影響. 山東農業大學學報（自然科學版），2018，49（3）：518-522，527.

[13]張峰峰，周 可，謝鳳行，等. 解淀粉芽孢桿菌HN固體菌劑發酵制備技術研究. 中國飼料，2018（23）：33-39.

[14]陳 成. 一株解淀粉芽孢桿菌產抗真菌物質的研究. 廣州：華南理工大學，2010：13-22.

[15]Chen X，Scholz R，Borriss M，et al. Difficidin and bacilysin produced by plant-associated Bacillus amyloliquefaciensare efficient in controlling fire blight disease. Journal of Biotechnology 2009，140（1/2）：38-44.