茄子SmWRKY65 基因克隆及其對(duì)青枯病的抗性分析

劉 開(kāi)，余炳偉，李丹丹，陳 娜，曹必好

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】茄子（Solanum melongenaL.）是茄科茄屬常見(jiàn)的蔬菜作物，起源于東南亞的熱帶地區(qū)，在我國(guó)南北各地廣泛栽培，其根、莖、葉皆可入藥，果實(shí)中富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、龍葵堿和多種微量元素，既可用作蔬食，又具有降血壓、防治胃癌等功效［1］，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值極高。青枯病是茄子栽培中常見(jiàn)的細(xì)菌性土傳病害之一，其致病因子是青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum），主要從根部侵入寄主植物的維管束部位并迅速擴(kuò)散到地上部組織，對(duì)植株可造成毀滅性的破壞［2］。土溫20 ℃左右時(shí)為茄子青枯病的發(fā)病高峰期，微酸性土壤、連作以及氣溫急劇上升等都會(huì)導(dǎo)致青枯病嚴(yán)重發(fā)生［3］。我國(guó)茄子青枯病發(fā)生較為普遍，發(fā)病時(shí)嚴(yán)重影響茄子的產(chǎn)量和品質(zhì)，導(dǎo)致茄子大面積減產(chǎn)減收［3］。但茄子抗青枯病的分子機(jī)理十分復(fù)雜，涉及多種因子調(diào)控，迄今仍未研究清楚。因此，深入開(kāi)展茄子抗青枯病的相關(guān)研究顯得尤為重要。

【前人研究進(jìn)展】植物WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是一種具有多功能調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，最早是從甘薯〔Dioscorea esculenta（Lour.）Burkill〕的SPF1基因中被鑒定出來(lái)的，因參與調(diào)控甘薯中的糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程而備受關(guān)注［4］。之后，陸續(xù)從野燕麥（Avena fatuaL.）、歐芹〔Petroselinum crispum（Mill.）Hill〕和水稻（Oryza sativaL.）的基因中成功鑒定出相應(yīng)的WRKY基因，并詳細(xì)闡明了其在植物生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其抗逆過(guò)程中發(fā)揮的重要作用［5-7］。近年來(lái)，關(guān)于WRKY 轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)生物脅迫及非生物脅迫相關(guān)過(guò)程的研究多有報(bào)道［8］。研究發(fā)現(xiàn)，小麥TaWRKY2和陸地棉GhWRKY33基因是響應(yīng)干旱調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因，過(guò)表達(dá)TaWRKY2和GhWRKY33基因能夠分別增強(qiáng)小麥和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗旱性［9-10］；決登偉等［11］發(fā)現(xiàn)，玉米ZmWRKY25-like基因在響應(yīng)鹽脅迫和低溫脅迫中上調(diào)表達(dá)；Sun 等［12］認(rèn)為，山葡萄VaWRKY33基因在低溫脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)以增強(qiáng)植株的耐寒性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗病性方面起關(guān)鍵作用。周茜茜等［13］研究發(fā)現(xiàn)，蘋果MdWRKY40基因通過(guò)介導(dǎo)水楊酸（Salicylic acid，SA）信號(hào)途徑正向調(diào)控蘋果對(duì)輪紋病菌的抗性；龍琴等［14］認(rèn)為，過(guò)表達(dá)CsWRKY61能夠激活與生物脅迫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的途徑，增強(qiáng)柑橘對(duì)潰瘍病的抗性；殷麗華等［15］研究發(fā)現(xiàn)，小豆VaWRKY33基因能夠響應(yīng)豇豆單胞銹菌的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，并明顯提高小豆銹病的抗性；在擬南芥抗病性研究中發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtWRKY61和AtWRKY70基因分別正向調(diào)控蕪菁皺葉病毒和丁香假單胞菌的抗性［16-17］；王丹等［18］研究發(fā)現(xiàn)，VqWRKY53通過(guò)促進(jìn)SA 和芪類物質(zhì)的合成，可增強(qiáng)中國(guó)野生毛葡萄植株的抗病性。

【本研究切入點(diǎn)】目前已有研究在茄屬植物歐白英（Solanum dulcamara）的基因組中克隆得到WRKY基因，并對(duì)其相應(yīng)的生物信息學(xué)功能進(jìn)行了分析［19］，但與茄子青枯病抗性相關(guān)的研究仍鮮見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)克隆與茄子青枯病抗性相關(guān)的SmWRKY65基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)、亞細(xì)胞定位及時(shí)空表達(dá)模式分析，并以清水和pTRV2空載為對(duì)照，構(gòu)建pTRV2-SmWRKY65載體，探究SmWRKY65在茄子抗病植株（E-31）中沉默后對(duì)茄子青枯病的響應(yīng)情況，以期為茄子青枯病抗病機(jī)理的相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)，為茄子青枯病抗性品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

茄子抗病材料（S.melongenaL.E-31，R）和感病材料（S.melongenaL.E-32，S）由曹必好教授提供。青枯菌致病菌株從感病材料中分離得到，VIGS 載體構(gòu)建所需的煙草脆裂病毒載體pTRV-1和pTRV-2由華南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，DH5α 大腸桿菌轉(zhuǎn)化菌株和GV3101 轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌菌株均購(gòu)自生工生物科技有限公司。

RNA 提取試劑盒Trizol 購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司，PCR 反應(yīng)試劑盒2×HiFiTaq PCR StarMix、快速DNA 膠回收試劑盒StarPrep 和快速質(zhì)粒小提試劑盒StarPrep 均為GenStar 產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript?ⅡQ Select RT SuperMix for qPCR 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒a SYBR Premix Ex Taq kit 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茄子不同組織部位總RNA 的提取與cDNA 的合成 在茄子幼苗三葉期時(shí)分別采集茄子根、莖、葉部位的樣品，用錫箔紙包裹并迅速放入液氮中，每個(gè)樣品3 次重復(fù)并做好標(biāo)記，之后采用Trizol 試劑盒的方法分別提取茄子根、莖、葉的RNA，并采用HiScript?ⅡQ Select RT SuperMix for qPCR 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，詳細(xì)步驟參照說(shuō)明書。cDNA 合成PCR 反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，10 min；50 ℃，30 min；85 ℃，5 min。

1.2.2SmWRKY65序列的獲得與基因克隆 本課題組前期通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到WRKY65基因序列（登錄號(hào)：Sme2.5_00423.1_g00013.1）。利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（SmWRKY65-F、SmWRKY65-R，表1），以茄子葉片cDNA 為模板通過(guò)PCR（10 μL 體系）擴(kuò)增得到SmWRKY65基因序列。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物的特異性，將條帶明亮、大小與預(yù)期一致的條帶采用StarPrep 快速DNA 膠回收試劑盒進(jìn)行純化。

1.2.3SmWRKY65的生物信息分析 利用ExPASy ProtParam tool（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）對(duì)SmWRKY65 蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析；使用ProtScale（http://ca.expasy.org/tools/protscale.html）和SOPM 工具（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=np-sa_sopma.html）分別預(yù)測(cè)SmWRKY65 蛋白親/疏水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)類型；使用NCBI CD Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc-ture/cdd/wrpsb.cgi）和PredictProtein 工具（http://www.predictprotein.org/）對(duì)SmWRKY65 蛋白序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域和結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)；通過(guò)NCBI Blast 在線比對(duì)工具，檢索SmWRKY65同源性基因，將相似性較高的同源性序列下載后，利用MEGA 7.0 軟件UPGMA 法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 PCR 產(chǎn)物的連接與SmWRKY65 質(zhì)粒的提取 將上述1.2.2 中的PCR 產(chǎn)物連接pMD 19-T載體（pMD 19-T 載體:Solution I :回收產(chǎn)物=0.5 μL :4.5 μL :5 μL），之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，用pMD19-T 通用引物檢測(cè)陽(yáng)性菌落，委托廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，確定重組子。挑取重組子進(jìn)行擴(kuò)搖，采用StarPrep 快速質(zhì)粒小提試劑盒提取SmWRKY65 質(zhì)粒，具體步驟參照說(shuō)明書。

1.2.5SmWRKY65的時(shí)空表達(dá)模式分析 利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)SmWRKY65熒光定量引物（q-SmWRKY65-F、q-SmWRKY65-R，表1），以茄子內(nèi)參18S rRNA（18S rRNA-F、18S rRNA-R，表1）為對(duì)照，采用a SYBR Premix Ex Taq Kit 試劑盒對(duì)茄子根、莖、葉組織進(jìn)行SmWRKY65實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）表達(dá)量的測(cè)定，詳細(xì)步驟參照說(shuō)明書。再分別以茄子抗病和感病植株為材料，在茄子苗3 葉期接種青枯病菌以分析SmWRKY65在茄子抗病和感病植株中的表達(dá)情況，并在接種后0、3、6、9 h 4 個(gè)時(shí)間段分別采集抗病、感病植株葉片，以茄子內(nèi)參18S rRNA（18S rRNA-F、18S rRNA-R，表1）為對(duì)照，采用SmWRKY65熒光定量引物（q-SmWRKY65-F、q-SmWRKY65-R，表1）進(jìn)行qRT-PCR 表達(dá)量的測(cè)定，以分析SmWRKY65在抗病和感病材料中的表達(dá)量差異。qRT-PCR 程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s、56 ℃退火20 s、72 ℃延伸35 s，35 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3 次生物學(xué)重復(fù)，最后取平均值進(jìn)行分析，基因的相對(duì)表達(dá)量應(yīng)用2-ΔΔCt 方法進(jìn)行分析［20］。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6 構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體及轉(zhuǎn)化洋蔥 利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)SmWRKY65亞細(xì)胞定位引物（SmWRKY65-GFP-EB-F、SmWRKY65-GFPEB-R，表1），通過(guò)PCR 反應(yīng)克隆SmWRKY65亞細(xì)胞定位目的片段。使用EcoR I 和BamH I 酶對(duì)亞細(xì)胞定位載體pC018 和目的片段進(jìn)行雙酶切并連接成重組質(zhì)粒SmWRKY65-GFP，測(cè)序后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，轉(zhuǎn)化洋蔥內(nèi)表皮組織，3 d 后在顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位結(jié)果。

1.2.7 VIGS 載體的構(gòu)建 通過(guò)在線工具（vigs.solgenomics.net）尋找特異性的VIGS 載體區(qū)域，根據(jù)pTRV2載體多克隆位點(diǎn)所包含的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物（pTRV2-WRKY65-F、pTRV2-WRKY65-R，表1），以茄子葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)獲得長(zhǎng)度為250 bp 左右的特異性PCR 產(chǎn)物，用雙酶切（EcoR I 和BamH I）法將產(chǎn)物片段連接到pTRV2載體上，之后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，陽(yáng)性單菌落進(jìn)行PCR 菌落篩選，送廣州擎科生物科技有限公司測(cè)序，確定重組子。將陽(yáng)性單菌落進(jìn)行擴(kuò)搖，提取重組質(zhì)粒（pTRV2-SmWRKY65）后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 用于侵染。

1.2.8 農(nóng)桿菌侵染茄子幼苗 將抗病和感病茄子種子分別播種在含泥炭和珍珠巖的混合基質(zhì)中，于25 ℃、16 h 光照和8 h 黑暗的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)茄子幼苗長(zhǎng)至3～4 片真葉時(shí)，吸取含有重組質(zhì)粒（pTRV2-SmWRKY65）的陽(yáng)性菌落擴(kuò)搖后配制成侵染液，并將分離到的青枯菌采用傷根斷根法對(duì)茄子幼苗進(jìn)行侵染，青枯菌的分離與接種參照曹必好等［21］的方法，每組15 株，3 次重復(fù)，之后在16 ℃、60 %的相對(duì)濕度下暗處理1 d，隨后置于培養(yǎng)室中生長(zhǎng)。3 d 后采用斷根法接種青枯病菌，觀察其表型變化并拍照，2 周后調(diào)查統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，方法參照Chen 等［22］，之后通過(guò)qRT-PCR 法測(cè)定pTRV2-SmWRKY65沉默植株表達(dá)量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0 進(jìn)行t檢驗(yàn)，采用Excel 2010 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SmWRKY65 基因的克隆

以茄子葉片cDNA 為模板，通過(guò)PCR 擴(kuò)增得到948 bp 的SmWRKY65片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示目的條帶與預(yù)期結(jié)果一致（圖1），將目的條帶切膠回收、純化、測(cè)序。對(duì)SmWRKY65測(cè)序序列與WRKY65原始序列（登錄號(hào)：Sme2.5_00423.1_g00013.1）在DNAMAN 8.0工具上進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示同源性為88.06%，表明在茄子中成功克隆了SmWRKY65（圖2）。

圖1 SmWRKY65 電泳結(jié)果Fig.1 Electropherogram result of SmWRKY65

2.2 SmWRKY65 蛋白的生物信息學(xué)分析

SmWRKY65 蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，該基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?34 個(gè)核苷酸序列，編碼277 個(gè)氨基酸殘基，蛋白相對(duì)分子量大小為30155.21 ku，等電點(diǎn)為5.51，分子式為C1304H1998N30O430S13，原子總量為4115，預(yù)測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白。對(duì)SmWRKY65 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，其主要由不規(guī)則盤繞結(jié)構(gòu)（72.92%）、α-螺旋（12.27%）、延伸鏈（11.91%）和β-轉(zhuǎn)角（2.89%）等結(jié)構(gòu)元件組成（圖3）。預(yù)測(cè)該蛋白屬于WRKY 家族，在71～131 區(qū)域具有1 個(gè)含60 個(gè)氨基酸的WRKY 保守域，可以特異結(jié)合DNA 序列（T）（T）TGAC（C/T），具有DNA 結(jié)合位點(diǎn)3 個(gè)、蛋白結(jié)合位點(diǎn)3 個(gè)、核苷酸多肽鏈結(jié)合位點(diǎn)2 個(gè)、大分子結(jié)合區(qū)域7 個(gè)，主要多集中在WRKY 家族的保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)，預(yù)測(cè)該基因定位于細(xì)胞核中（圖4）。通過(guò)NCBI 上Blast 在線比對(duì)工具，將檢索到的12條與SmWRKY65同源性較高的基因進(jìn)行多序列比對(duì)，使用MEGA 7.0.21 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，茄子SmWRKY65與馬鈴薯、番茄的WRKY65同源性最高（圖5）。

2.3 SmWRKY65 的時(shí)空表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位分析

以茄子葉片cDNA 為模板，通過(guò)PCR 檢測(cè)SmWRKY65熒光定量引物的特異性，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在250 bp 左右有1 條明亮且符合預(yù)期的條帶（圖6A），說(shuō)明引物特異性較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。對(duì)茄子根、莖、葉不同組織部位表達(dá)量的分析結(jié)果顯示，SmWRKY65在茄子根組織部位中的表達(dá)量最高，在葉中的表達(dá)量次之，莖中最低（圖6B）。在茄子苗期接種青枯病菌后0、3、6、9 h 4 個(gè)時(shí)間段分別采集抗病、感病植株葉片進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，結(jié)果表明，SmWRKY65在抗病和感病材料中的表達(dá)量均隨接種時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，9 h 時(shí)達(dá)到最高，且在抗病材料中的表達(dá)水平明顯高于在感病材料中的表達(dá)水平（圖6C），說(shuō)明SmWRKY65響應(yīng)茄子青枯病抗性相關(guān)基因的表達(dá)。

使用EcoR I 和BamH I 酶對(duì)亞細(xì)胞定位載體pC018 和亞細(xì)胞定位引物成功克隆出的PCR 片段進(jìn)行雙酶切，并連接成大小為831 bp 的重組質(zhì)粒SmWRKY65-GFP（圖7A），將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下觀察到SmWRKY65定位在細(xì)胞核中表達(dá)（圖7B），這與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖6 茄子不同組織及抗感病植株中SmWRKY65 的表達(dá)分析Fig.6 SmWRKY65 expression of different tissues and disease-resistant and disease-susceptible plants of eggplant

圖7 SmWRKY65 亞細(xì)胞定位分析Fig.7 Subcellular localization analysis of SmWRKY65

2.4 SmWRKY6 沉默在抗病茄子中響應(yīng)青枯病的情況

2.4.1pTRV2-SmWRKY65載體構(gòu)建結(jié)果 以茄子葉片為材料提取RNA 并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，再以cDNA 為模板，利用構(gòu)建VIGS 載體所設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，獲得長(zhǎng)度為242 bp 的PCR 產(chǎn)物（圖8A），將產(chǎn)物片段和pTRV2 載體同時(shí)用EcoR I和BamH I 進(jìn)行雙酶切后成功將SmWRKY65連接到pTRV2載體上獲得重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序保證連接片段和讀碼方向正確后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。從陽(yáng)性菌落檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，與pTRV2（圖8B1）空載相比，pTRV2-SmWRKY65（圖8B2）載體構(gòu)建成功。

圖8 pTRV2-SmWRKY65 載體構(gòu)建Fig.8 pTRV2-SmWRKY65 vector construction

2.4.2 青枯病菌接種VIGS 沉默植株 為了驗(yàn)證pTRV2-WRKY65沉默植株對(duì)茄子青枯病的響應(yīng)情況，在3～4 片真葉時(shí)，對(duì)茄子抗病植株接種青枯病病原菌。接種7 d 后觀察到接種清水的葉片均沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的萎蔫癥狀，接種pTRV2空載的植株僅有1 片葉片出現(xiàn)萎蔫，而接種pTRV2-WRKY65的15 株植株幾乎全部表現(xiàn)出萎蔫癥狀；接種2 周后，對(duì)pTRV2-WRKY65植株進(jìn)行病情指數(shù)調(diào)查，結(jié)果（表2）表明，SmWRKY65基因被沉默后影響了抗病材料對(duì)青枯病的抵御能力，即表現(xiàn)為感病癥狀。pTRV2-SmWRKY65實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)結(jié)果（圖9）顯示，與清水和pTRV2空載相比，pTRV2-SmWRKY65表達(dá)量明顯下降。

表2 VIGS 沉默植株的病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of disease index of VIGS silent plants

圖9 VIGS 沉默植株的表型（A）及qRT-PCR 分析（B）Fig.9 Phenotype（A）and qRT-PCR analysis（B）of VIGS silent plants

3 討論

茄子是我國(guó)南北各地廣泛栽培的夏秋季重要蔬菜之一，在我國(guó)的栽培歷史悠久，種植面積大，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但茄子易受青枯病侵襲，尤其在我國(guó)南方地區(qū)，其病原菌適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣泛、繁殖速度較快，常規(guī)方法難以有效防治，而抗病育種可以有效防御病菌的危害，能較大幅度提高茄子的產(chǎn)量和品質(zhì)［2,23］。近年來(lái)，研究人員在提高茄子青枯病抗性及抗病品種選育方面作了較多努力。邵欣欣［24］在茄子青枯病抗性研究中發(fā)現(xiàn)，ERF 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控茄子抗青枯病的信號(hào)途徑；肖熙鷗等［25］研究認(rèn)為，SA 信號(hào)途徑中MAPK6、MKK2、NPR1、PAD4等基因能夠正向調(diào)控茄子青枯病的抗性；李威等［26］研究發(fā)現(xiàn)，1.5～2.0 mmol/L 的硅濃度處理可有效提高快圓茄青枯病的抗性；Qiu 等［27］認(rèn)為，過(guò)表達(dá)SmMYB44可誘導(dǎo)茄子中亞精胺相關(guān)基因（SmSPDS）的表達(dá)，促進(jìn)亞精胺的合成與積累，從而增加對(duì)茄子青枯病的抗性。此外，廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)過(guò)多年研究選育出的翡翠綠2 號(hào)青茄新品種在大田抗病性鑒定中表現(xiàn)為中抗青枯病［28］，與廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所聯(lián)合選育出的紫榮6 號(hào)和玫瑰紫花茄均為抗青枯病的優(yōu)質(zhì)茄子新品種［29-30］。

研究表明，在生物脅迫下，植物體內(nèi)會(huì)通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑和防御反應(yīng)作出應(yīng)激防衛(wèi)，而轉(zhuǎn)錄因子在這一系列反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［31］。近年來(lái)有關(guān)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植株抗病性上的研究成為一個(gè)熱門話題［32］。已有研究報(bào)道，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子涉及調(diào)控與青枯病抗性相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。王鵬飛等［33］研究發(fā)現(xiàn)，野生花生AdWRKY37基因在受到青枯病菌液脅迫誘導(dǎo)后表達(dá)量明顯升高，并推測(cè)該基因可能通過(guò)介導(dǎo)水楊酸（Salicylic acid，SA）和茉莉酸（Jasmonic acid，JA）途徑參與青枯病抗病相關(guān)過(guò)程的調(diào)控；Dang 等［34］認(rèn)為，CaWRKY27 轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)節(jié)SA、JA 和內(nèi)皮素（Endothelin，ET）介導(dǎo)的信號(hào)通路，可增強(qiáng)煙草對(duì)青枯菌的抗性；Liu 等［35］發(fā)現(xiàn)，在煙草中過(guò)表達(dá)NtWRKY50能夠促進(jìn)SA 合成，從而增強(qiáng)植株對(duì)青枯病的抗性；Dang 等［36］在辣椒抗病育種的研究中發(fā)現(xiàn)，CaWRKY41 轉(zhuǎn)錄因子能夠提高辣椒對(duì)青枯菌的抗性。然而，有關(guān)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在茄子青枯病抗性中的相關(guān)研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以茄子葉片cDNA 為模板成功克隆了SmWRKY65基因，與茄子數(shù)據(jù)庫(kù)中原始WRKY65序列比對(duì)同源性為88.06%，序列差異性的產(chǎn)生可能與PCR 擴(kuò)增過(guò)程中單核苷酸堿基變異及引物二聚體的形成有關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果表明，SmWRKY65在茄子抗病和感病植株中均響應(yīng)青枯病的誘導(dǎo)，其表達(dá)量在接種青枯病菌后0、3、6、9 h 4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)不斷升高，且SmWRKY65在茄子抗病材料中的表達(dá)水平明顯高于感病材料，說(shuō)明SmWRKY65可能涉及茄子青枯病抗病的調(diào)節(jié)過(guò)程。在抗病茄子（E-31）植株中接種青枯菌的分析結(jié)果顯示，與清水和pTRV2空載相比，SmWRKY65沉默植株表現(xiàn)出明顯的萎蔫、易感癥狀，且qT-PCR 分析表明SmWRKY65在茄子中的表達(dá)量較清水和pTRV2空載明顯降低，這表明SmWRKY65沉默后可能抑制了茄子青枯病抗病信號(hào)途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，從而降低了茄子植株對(duì)青枯病原菌的抗性。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了SmWRKY65基因，與茄子數(shù)據(jù)庫(kù)中原始WRKY65序列的同源性為88.06%，該基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?34 個(gè)核苷酸序列，編碼277 個(gè)氨基酸殘基，在71～131 區(qū)域包含1 個(gè)含60 個(gè)氨基酸的WRKY 保守域，定位于細(xì)胞核中，與馬鈴薯、番茄WRKY65的同源性最高。時(shí)空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，SmWRKY65在茄子根組織中的表達(dá)量最高，葉中次之，莖中最低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析發(fā)現(xiàn)，SmWRKY65在茄子抗病和感病材料中均響應(yīng)青枯病菌的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，且在抗病材料中的表達(dá)水平明顯高于感病材料；VIGS 結(jié)果表明，接種pTRV2-SmWRKY65植株的葉片表現(xiàn)出明顯的萎蔫癥狀，結(jié)合qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，pTRV2-SmWRKY65表達(dá)量較對(duì)照明顯下降，表明SmWRKY65沉默后茄子抗青枯病的能力下降，說(shuō)明SmWRKY65可能涉及茄子青枯病抗病相關(guān)過(guò)程的調(diào)控。