二化螟對薄荷精油化學成分的電生理及行為反應

楊 雪 ，胡 陽，王梓懿 ，王照國 ，余 帥，安正斌，夏 宇，李?

（1.貴州醫科大學省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014；2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室/貴州省天然藥物工程研究中心，貴州 貴陽 550014；3.貴州省農業科學院植物保護研究所，貴州 貴陽 550006）

【研究意義】二化螟（Chilo suppressalisWalker）是鱗翅目草螟科的一種害蟲。二化螟幼蟲作為鉆蛀性及寡食性害蟲，主要為害水稻及茭白等禾本科作物。二化螟屬兼性滯育種類，以4～6齡幼蟲在稻蔸滯育越冬，平均每年發生1～5代，江淮稻區常年發生2代［1］。在水稻苗期二化螟幼蟲的為害可造成水稻苗枯鞘和枯心等癥狀，在水稻孕穗期和穗期二化螟幼蟲的為害會造成稻苗白穗、枯孕穗和蟲傷株等癥狀，嚴重降低水稻的產量和質量［2］。最近幾年二化螟種群的數量呈現出一定的回升趨勢，主要原因包括其寄主植物的種植規模越來越大、水稻種類的替換、耕作方式發生改變以及氣候的變化等，其為害性逐年加劇，故有人將其與蝗蟲并列，稱它們為“南螟北蝗”［3］。目前對二化螟的防治主要依賴于化學藥劑，而長期以及連續不合理的使用化學藥劑使得二化螟對其產生了不同水平的抗藥性［4］。因此，尋找環境友好型防治二化螟的措施十分必要和迫切。

【前人研究進展】隨著目前化學生態學的快速發展，對于植物與昆蟲之間產生的化學信息聯系的研究成為新的重點研究領域之一。植物精油中含有多種低沸點、易揮發的成分，且具有強烈的特殊氣味。植物精油按一定比例構成化學指紋圖譜，并能夠影響昆蟲對于寄主植物的定位、逃避敵害、交配、產卵、取食等行為，在昆蟲行為調控和植物防御過程中起著重要作用［5］。薄荷（Mentha haplocalyxBrig.）為唇形科多年生草本植物，其入藥部分為地上干燥部分。夏秋二季莖、葉茂盛或花開至三輪時，選晴天，分次采割，陰干或曬干，其性辛、涼，歸肺、肝經。具有疏散風熱、清利頭目、利咽、透疹的作用、用于風熱感冒、風溫初起、頭痛、目赤、喉痹、口瘡、風疹、麻疹、胸脅脹悶等［6］，我國南北各省均有分布，主產于江蘇、江西、湖南等省。據報道，薄荷精油對白紋伊蚊（Aedes albopictus）具有驅避作用，活性成分為右旋8-乙酰氧基別二氫葛縷酮［7］。李中姍等研究了香草根揮發油中萜類化合物對二化螟具有引誘作用［8］。鄭許松等通過二化螟在香草根和水稻之間產卵和幼蟲存活的情況進行研究，發現二化螟更傾向于將卵產在香草根上，表明二化螟對香草根具有強烈的吸引作用［9］。高廣春等研究表明香草根提取物對剛孵化的二化螟幼蟲具有一定的毒殺活性［10］。王廣利等報道二化螟對16 種香草根揮發物產生EAG 反應［11］。查閱文獻，我們可以得知很多研究者都是對薄荷精油的抗菌和防腐作用的研究。Espiritu 等報道了薄荷甲醇提取物對大腸桿菌具有顯著的抑制作用［12］。野生薄荷精油清除超氧陰離子自由基和羥基自由基的能力較強［13］。另外，He 等從薄荷精油中分離出25 個葡萄糖苷類化合物，活性測定結果顯示這些化合物對葡萄糖苷酶具有抑制活性［14］。薄荷屬植物椒樣薄荷（Mentha piperitaL.）和蘇格蘭留蘭香（Mentha cardiacG.）精油可抑制多種細菌的生長，該2 種薄荷植物提取精油后，所剩余殘渣的甲醇提取物DPPH 自由基具有較強的清除作用［15］。

【本研究切入點】薄荷精油中含有豐富的的萜類化合物，同時薄荷精油對二化螟行為研究未見報道。通過前期對實驗室所提取的全部精油篩選出了薄荷精油對二化螟有取食引誘活性。因此本試驗測試了薄荷精油對二化螟幼蟲的取食趨向的影響，在此基礎上，測試了二化螟對薄荷精油的觸角電位反應，并采用氣相色譜-觸角電位聯用儀（GC-EAD）分析了薄荷精油中的活性成分，為揭示薄荷精油調控農業害蟲的行為提供依據。【擬解決的關鍵問題】薄荷精油是否對二化螟的取食有影響，薄荷精油中不同化合物對二化螟雌雄成蟲是否產生電生理反應。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蟲源：二化螟三齡幼蟲由貴州省農業科學院植物保護研究所室提供，二化螟成蟲由南京農業大學植物保護學院提供。

植物材料：留蘭香薄荷地上部分于2018 年4月采自貴州省貴陽市沙文，陰干備用。

主要儀器：GC-EAD 系統由裝有HP-5（30 m×0.25 mm）色譜柱、FID 檢測器的氣相色譜（Angilent 5890 B）和觸角電位儀（Syntech）組成。觸角電位儀由荷蘭Syntech 公司生產的智能化數據獲取控制器IDAC-4、微動操作儀Syntech MN-151、刺激氣流控制器Syntech CS-55 和Syntech軟件處理系統組成。

主要試劑：正己烷（分析純，天津市凱通化學試劑有限公司），配制成0.1、1、10、100、1000、10000 mg/L 6 個濃度梯度。乙醚、丙酮（分析純，天津富宇精細化工有限公司），無水硫酸鈉（分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 精油提取 采用水蒸氣蒸餾法提取薄荷精油：將采集的薄荷樣品粉碎，過0.850 mm篩，稱量500 g，置1000 mL 圓底燒瓶中，加水500～900 mL，浸泡12 h，組裝好水蒸氣蒸餾裝置。用電加熱套緩緩加熱圓底燒瓶至沸騰，并一直保持微沸的狀態約5 h，直至無油狀物流出為止。用等體積的乙醚萃取餾出液3 次，合并乙醚層，用無水硫酸鈉進行干燥，過濾掉無水硫酸鈉，用旋轉蒸發儀去除乙醚，得到薄荷精油，在4 ℃密封保存備用。

1.2.2 二化螟幼蟲非選擇性拒食活性測試 采用稱重法測試拒食活性［16］：選取三齡二化螟幼蟲為測試昆蟲，將受試昆蟲饑餓24 h，逐頭編號稱重，以丙酮為溶劑，采用二倍稀釋法將薄荷精油配制成5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 mg/mL的系列濃度。以丙酮溶液為對照，每個濃度3 次重復，每個重復10 頭試蟲。選取新鮮稻莖，切割成2 cm，在藥液中浸漬5 s，自然晾干后放入培養皿中，接入1 頭試蟲，每天更換帶藥稻莖，飼養7 d，取出稱重，計算拒食率。

1.2.3 氣相色譜-觸角電位聯用儀（GC-EAD）測試 樣品用GC-EAD 進行分析［17］，每次進樣量為2 μL（濃度為10 mg/mL），進樣口溫度220 ℃，檢測器溫度250 ℃，載氣為流速 1 mL/min 的99.999% N2，不分流進樣。升溫程序：初始溫度從50 ℃保持2 min，以升溫速度10 ℃/min 升至210 ℃，再以10 ℃/min 的速度升至280 ℃，運行25 min，柱前壓7.65 psi，載氣流量1.0 mL/min，分流比20 ∶1，溶劑滯后時間 4.0 min。將羽化后2 d 的成蟲觸角剪下，接到觸角電位儀上，測試方法同上。

質譜條件：電子能量70 eV，離子源為EI源，EI 源溫度230 ℃，發射電流34.6 μA，四極桿溫度150 ℃，倍增器電壓1482 V，質量范圍29～500 amu。

采用氣相色譜-質譜-計算機聯用儀進行分析鑒定，各峰經質譜計算機數據系統檢索，標準圖譜庫Nist 2005 和Wiley 275，確定精油中的化合物結構，用峰面積歸一化法確定各化學成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 二化螟幼蟲非選擇性拒食活性

表1 為不同濃度薄荷精油對二化螟三齡幼蟲的拒食活性。由表1 可知，所有測試濃度均表現出顯著的引誘取食作用，且隨著濃度的降低，引誘取食作用越強。當濃度為0.15625 mg/mL 時，取食率為123.01 %，故選取0.1 mg/mL 薄荷精油用于測定二化螟雌雄成蟲觸角電位反應的濃度。

表1 不同濃度薄荷精油對二化螟幼蟲的引誘取食活性Table 1 Feeding attraction activities of different concentrations of essential oil of Mentha haplocalyx against Chilo suppressalis

2.2 薄荷精油化學成分分析

圖1 為薄荷精油GC-MS 離子流。由表2 可知，從薄荷精油中共檢測出27 個化合物，化合物含量占總含量的81.965 %，其中含量最多的為長葉薄荷酮，含量為15.854 %，其次為異薄荷腦，含量為15.206 %。氧化胡椒酮和順-胡椒酮氧化物的含量分別為13.044 %和12.655 %，異薄荷酮含量為9.067 %，其余化合物含量均較低。因長葉薄荷酮為薄荷精油的主要化合物，故測試了薄荷精油和長葉薄荷酮對二化螟雌雄成蟲的觸角電位反應。

圖1 薄荷精油GC-MS 離子流Fig.1 Ion flux of essential oil of Mentha haplocalyx

表2 薄荷精油主要化學成分Table 2 Chemical components of essential oil of Mentha haplocalyx

2.3 薄荷精油對二化螟雌雄成蟲氣相色譜-觸角電位聯用儀（GC-EAD）電位反應

二化螟雌性成蟲對薄荷精油的GC-EAD 反應見圖2，結果顯示薄荷精油中的12 種化合物能明顯引起雌蟲產生電生理反應，其中長葉薄荷酮的反應最為強烈，12 號未知物對二化螟雄蟲也有較明顯的反應，從GC-MS 分析可以看出，12 號未知物為菖蒲烯（0.489 %）、乙烯丁香酚（0.151 %）、4-環丙基-2-甲氧基苯酚（1.929 %）的混合物，它們的總含量僅為2.569 %，與長葉薄荷酮（15.854 %）的含量差別較大，故推測3 個化合物中的某個化合物對二化螟雄蟲的觸角電位有更大反應。

圖2 二化螟雌性成蟲對薄荷精油的GC-EAD 反應Fig.2 Gas chromatography-electroantennographic detection（GC-EAD）response of female adults of Chilo suppressalis to essential oil of Mentha haplocalyx

二化螟雄性成蟲對薄荷精油的GC-EAD 反應見圖3。與雌蟲不同，雄蟲對薄荷精油中的10 種化合物產生電生理反應，其中丁子香酚對二化螟雄蟲的電生理反應最為強烈。結合GC-MS 分析可知，丁子香酚旁的為薄荷烯酮醚，其對二化螟雄蟲的電生理反應影響也較為強烈。另外，丁子香酚在薄荷精油中的含量為11.692 %，而薄荷烯酮醚的含量僅為2.766 %，推測薄荷烯酮醚對二化螟雄蟲的電生理反應較丁子香酚強烈。

3 討論

圖3 二化螟雄性成蟲對薄荷精油的GC-EAD 反應Fig.3 Gas chromatography-electroantennographicdetection（GC-EAD）response of male adults of Chilo suppressalis to essential oil of Mentha haplocalyx

昆蟲的取食行為是指昆蟲在接受內外信息后，由神經系統和肌肉系統作出的綜合反應，表現出攝取食物以及與此相關的一系列活動［18］，一般同種昆蟲個體的取食行為既表現出種群的相似性又表現出種群所特有的固定模式。昆蟲對食物有一定的選擇性，用以識別和選擇食物的方式多種多樣，但多以化學刺激作為識別寄主的主要工具，昆蟲的取食行為取決于從化學感受器輸入的感覺信號，如植食性昆蟲通常以植物的次生代謝產物作為信息化合物或取食刺激劑［19］。昆蟲在覓食和尋找寄主行為中，嗅覺感受器發揮著極其重要的作用，即通過嗅覺感受植物揮發物以識別寄主及確認取食適合度，昆蟲可通過味覺感受系統辨別促進取食的營養化合物和抑制取食的有毒化合物以確認和評估潛在食物［20］。芳香植物的氣味可影響昆蟲的行為［21-23］，從具有特殊氣味的植物中篩選出可顯著影響昆蟲行為的揮發性物質，是利用化學生態調控害蟲的主要研究方向之一。氣相色譜-觸角電位（GC-EAD）是昆蟲化學生態學中最重要的電生理技術，在研究昆蟲對信息化學物質的感受機理、篩選活性信息素成分或植物次生物質等方面發揮關鍵作用。

長葉薄荷酮在多種芳香植物的精油中被檢測出［24-27］，丁子香酚是植物丁香、丁香羅勒以及樟樹屬肉桂葉揮發油的主要成分，呈現出特殊辛辣味和強烈的丁香氣息［28］。丁子香酚抑菌活性較好，目前已有相關殺菌劑應用于農業實踐中。本試驗測試的薄荷精油中的異薄荷腦、氧化胡椒酮、順-胡椒酮氧化物、異薄荷酮含量也較高，但GC-EAD 結果顯示這些化合物對二化螟雌雄成蟲觸角的電生理反應不是很強烈。雌雄蟲觸角上化學感受器數量和類型有差異，導致雌雄蟲各自具備獨特的嗅覺感受和分辨能力，也可能與嗅覺感受器中相關嗅覺蛋白與精油中某種活性成分的結合能力有關。在自然界中，昆蟲雌雄個體在整個種群生存和繁衍過程中長期分工不同，也會導致其對植物氣味的反應在兩性間存在明顯的差異。在GC-EAD 測試中，作為刺激源的每種柱流出組分的量是不相同的，有可能會出現有行為活性的組分在樣品中含量太低而沒有觸角電位反應。具有觸角電位活性的化合物作為行為實驗的材料時，供試昆蟲不一定都對其產生趨性反應，主要是由于觸角電位反映的是嗅覺感受器對特定化合物反應電壓的強弱，而行為反應需要經歷嗅覺受體、神經中樞，依據大腦的判斷從而對運動器官進行調控。

不同產地、不同采摘時間的薄荷精油化學成分亦不同。王微等報道薄荷精油中異佛爾酮相對含量最高，達到41.22 %［29］。李鐵純等報道采自遼寧省遼中縣的薄荷精油中相對含量最高的化合物為香薷酮（58.90 %）［30］。本試驗測定結果相對含量最高的為長葉薄荷酮（15.854 %），可能是產地和采摘時間不同所致，推測其生物活性也有差異。

昆蟲誘食劑具有引誘害蟲取食更多沾有藥物的葉片，加速害蟲死亡，可提高藥效，本研究結果將為開發薄荷精油中的活性化合物為植物源誘食劑奠定基礎。

4 結論

本試驗測試了薄荷精油對二化螟三齡幼蟲的取食影響，結果顯示薄荷精油可顯著引誘二化螟幼蟲取食，考慮到處理組和對照組喂食的均為新鮮稻莖，可以排除味覺對取食變化的影響，故進一步測試了薄荷精油中不同化合物對二化螟雌雄成蟲觸角的電生理反應。GC-MS 分析結果顯示長葉薄荷酮是薄荷精油中的主要化合物。在此基礎上，本試驗采用GC-EAD 法測試了薄荷精油中不同化合物對二化螟雌雄成蟲的電生理反應，結果顯示雌蟲對長葉薄荷酮的電生理反應最為強烈，而雄蟲對丁子香酚的電生理反應最為強烈。