miR-190b通過PTEN/PI3K/AKT信號通路對腎母細胞瘤細胞SK-NEP-1增殖、遷移和凋亡的影響

張劍春, 陶 濤,劉俊啟

1)駐馬店市中心醫院新生兒科 河南駐馬店 463000 2)河南省人民醫院婦產科 鄭州 450003 3)河南省人民醫院腫瘤科 鄭州 450003

腎母細胞瘤又稱腎胚腫瘤，是兒童最常見的惡性腫瘤，約占兒童所有實體瘤的8%[1]。盡管目前的研究[2]發現了一些關于腎母細胞瘤的相關基因，例如p53、WT1、WTX和CTNNB1，但腎母細胞瘤發生發展的分子機制仍不清楚。微小RNA(miRNA)是一種內源性RNA，長度為18～25個核苷酸[3]。研究[4]表明，miR-190b在多種腫瘤組織中異常表達。PTEN/PI3K/AKT信號通路是各種腫瘤生物學過程中的關鍵信號通路，靶向PTEN通路的分子已廣泛用于腫瘤的治療[5]。PTEN/PI3K/AKT軸構成了一條重要的途徑，可控制多種生物信號傳導過程，例如代謝、凋亡、細胞生長和細胞增殖[6]。然而，PTEN/PI3K/AKT信號通路對腎母細胞瘤發病機制和進展的影響仍然未知。本研究旨在探討miR-190b對人腎母細胞瘤細胞SK-NEP-1增殖、遷移和凋亡的影響，為進一步闡明miR-190b在腎母細胞瘤中發揮的作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1主要材料組織標本：收集駐馬店市中心醫院2019年7～9月收治的20例腎母細胞瘤患者[男，8例，38～75(56.3±3.5)歲；女，12例，46～70(58.1±4.1)歲]的腫瘤組織、癌旁正常組織，保存在-80 ℃直至使用，患者均未在手術前進行化療，并經術后病理確診。患者均簽署知情同意書，所有實驗均獲得本院倫理委員會的批準與監督。細胞：人腎母細胞瘤細胞系SK-NEP-1購自中國科學院上海細胞生物學研究所。主要試劑：DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Trizol試劑、PrimeScriptTMRT Reagen試劑盒和SYBR?Premix EX TaqTMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-對照(NC)、miR-190b模擬物、miR-190b抑制劑由Genepharma公司合成；Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；pmirGLO載體、雙熒光素酶活性檢測試劑盒和8 μm孔徑的Transwell小室購自美國Promega公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒購自美國Abcam公司；PTEN、PI3K、p-AKT、AKT、β-actin抗體和山羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2細胞培養、分組與轉染SK-NEP-1細胞用含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基于37 ℃、體積分數5% CO2培養，2 d更換一次培養基。取對數生長期SK-NEP-1細胞分為4組。空白對照組：不進行任何處理；miR-NC組：轉染miR-NC質粒；miR-190b模擬物組：轉染miR-190b模擬物質粒；miR-190b抑制劑組：轉染miR-190b 抑制劑質粒。按照Lipofectamine 3000轉染試劑說明書將100 nmol/L的miR-NC、miR-190b模擬物、miR-190b抑制劑分別轉入SK-NEP-1細胞中，在37 ℃、體積分數5% CO2的培養箱中培養6 h后，更換新鮮的培養基繼續培養。48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.3qRT-PCR測定組織標本或SK-NEP-1細胞中miR-190b的表達用Trizol試劑提取組織標本或細胞總RNA，檢測總RNA的純度和含量，使用PrimeScriptTMRT Reagen試劑盒將提取的RNA反轉錄為cDNA。miR-190b正向引物序列為5’-GGGT GATATGTTTGATAT-3’，反向引物序列為5’-CAGT GCGTGTCGTGGAGT-3’，產物大小214 bp；內參U6正向引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，產物大小227 bp。PCR反應條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性15 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸75 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-190b的相對表達量。細胞實驗重復3次。

1.4免疫組化SP法測定組織中PTEN、PI3K、p-AKT蛋白的表達切取小塊組織，固定、常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，并制成5 μm厚的石蠟切片。切片在抗原修復液(96～98 ℃)中放置15 min。將切片放入新鮮配制的體積分數3% H2O2溶液中8 min，使內源性過氧化物酶滅活。接著滴加體積分數10%山羊血清封閉液，室溫孵育20 min后，用濾紙吸取多余液體。滴加PTEN、PI3K、p-AKT一抗(稀釋度1∶500)，4 ℃孵育過夜。之后滴加相應的二抗(稀釋度1∶1 000)，室溫孵育2 h。DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并采集圖像。目標蛋白呈棕黃色，則為陽性表達。高倍鏡下計數500個細胞中的陽性細胞數，計算陽性細胞百分比。

1.5miR-190b與PTEN靶向關系的預測和鑒定通過TargetScan數據庫分析miR-190b的靶基因。將PTEN 3’UTR野生型(WT)/突變型(MUT)克隆到pmirGLO載體中，然后將miR-NC或miR-190b模擬物與pmirGLO-PTEN-WT或pmirGLO-PTEN-MUT共轉染至SK-NEP-1細胞中，48 h后應用雙熒光素酶活性檢測試劑盒測定細胞的熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.6細胞集落形成實驗測定SK-NEP-1細胞的增殖能力各組細胞經處理48 h后，收集并接種到60 mm的培養皿中，2 d更換一次培養基。14 d后，用結晶紫染色，計數含有≥50個細胞的集落，并進行拍照。實驗重復3次。

1.7SK-NEP-1細胞侵襲、遷移能力的測定細胞侵襲能力測定：采用Transwell侵襲實驗。收集處理48 h后的各組細胞，消化后制成細胞懸液，調細胞密度為1×105個/mL。將Transwell小室之間用基質膠分隔，上室接種200 μL細胞懸液，下室加入600 μL完全培養基。然后將Transwell小室置于37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱中孵育12 h。取出基質膠，用棉簽擦去膠和頂室上的細胞，然后用40 g/L多聚甲醛固定并用結晶紫染色。200倍視野下選擇5個區域計數入侵細胞的數量并取平均值。實驗重復3次。

細胞遷移能力測定：采用Transwell遷移實驗。方法同上，但不用基質膠。實驗重復3次。

1.8SK-NEP-1細胞凋亡率的測定收集處理48 h后的各組細胞，離心并重懸于緩沖液中。將細胞依次用Annexin V溶液10 μL和PI溶液10 μL染色，室溫下黑暗中孵育30 min，然后使用流式細胞儀測定凋亡率。實驗重復3次。

1.9Western blot法檢測SK-NEP-1細胞中PTEN、PI3K、AKT、p-AKT蛋白的表達處理48 h后的各組細胞用RIPA裂解，提取總蛋白，按照BCA法進行定量。蛋白樣品經變性后上樣，按照實驗步驟進行電泳、轉膜、封閉(50 g/L脫脂奶粉液)、一抗孵育[PTEN、AKT、p-AKT、兔抗β-actin(稀釋度1∶2 000)或PI3K抗體(稀釋度1∶1 000)，4 ℃過夜]、二抗孵育[山羊抗兔IgG(稀釋度1∶1 000)，室溫1 h]、顯影曝光。采用Image-Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶進行灰度值測定，目的蛋白相對表達量為目的蛋白與內參條帶灰度值的比值。實驗重復3次。

1.10統計學處理采用SPSS 19.0進行數據分析。

腎母細胞瘤及癌旁正常組織中miR-190b相對表達量及PTEN、PI3K、p-AKT蛋白陽性細胞百分比的比較采用配對資料的t檢驗；兩組雙熒光素酶活性的比較采用兩獨立樣本的t檢驗；不同組間SK-NEP-1細胞miR-190b相對表達量、集落形成數、遷移細胞數、侵襲細胞數、凋亡率，PTEN、PI3K蛋白相對表達量及p-AKT/AKT的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1兩組組織中miR-190b表達的比較結果(表1)顯示，腎母細胞瘤組織中miR-190b的相對表達量高于癌旁正常組織。

2.2兩組組織中PTEN、PI3K、p-AKT蛋白表達的測定結果(圖1和表1)顯示，PTEN和PI3K主要在細胞質中表達，而p-AKT主要在細胞核中表達。腎母細胞瘤組織中PTEN的陽性細胞百分比低于癌旁正常組織，PI3K和p-AKT的陽性細胞百分比高于癌旁正常組織。

2.3miR-190b與PTEN靶向關系的預測和鑒定TargetScan預測miR-190b和PTEN之間的結合位點見圖2。雙熒光素酶報告實驗結果(表2)顯示，PTEN 3’UTR WT和miR-190b模擬物共轉染的SK-NEP-1細胞中的熒光素酶活性降低。

2.4各組SK-NEP-1細胞中miR-190b相對表達量的比較結果(表3)顯示，miR-190b模擬物組中miR-190b相對表達量高于空白對照組和miR-NC組，miR-190b抑制劑組中miR-190b相對表達量低于空白對照組和miR-NC組。

表1 兩組組織中miR-190b相對表達量及PTEN、PI3K、p-AKT蛋白陽性細胞百分比的比較(n=20)

圖1 癌旁正常(上排)及腎母細胞瘤(下排)組織中PTEN、PI3K、p-AKT蛋白表達的檢測(SP，×200)

圖2 miR-190b與PTEN之間的結合位點

表2 雙熒光素酶報告實驗熒光素酶活性測定結果(n=3)

表3 各組SK-NEP-1細胞中miR-190b相對表達量的比較(n=3)

2.5各組SK-NEP-1細胞增殖、侵襲與遷移能力及凋亡率的比較細胞集落形成實驗結果(圖3和表4)顯示，與空白對照組和miR-NC組相比，miR-190b模擬物組SK-NEP-1細胞增殖能力提高，miR-190b抑制劑組增殖能力下降。細胞侵襲、遷移實驗及凋亡率檢測結果(表4)顯示，與空白對照組和miR-NC組相比，miR-190b模擬物組的遷移和侵襲能力提高，凋亡率下降;miR-190b抑制劑組的遷移和侵襲能力下降，凋亡率上升。

2.6各組SK-NEP-1細胞中PTEN、PI3K蛋白相對表達量及p-AKT/AKT的比較Western blot結果(圖4和表5)表明，與空白對照組和miR-NC組相比，miR-190b模擬物組中PTEN蛋白表達下調，而PI3K和p-AKT/AKT上調；miR-190b抑制劑組PTEN蛋白表達上調，PI3K和p-AKT/AKT下調。

A：空白對照組；B：miR-NC組；C：miR-190b模擬物組；D：miR-190b抑制劑組

表4 各組SK-NEP-1細胞集落形成數、遷移細胞數、侵襲細胞數、凋亡率的比較(n=3)

1：空白對照組；2：miR-NC組；3：miR-190b模擬物組；4：miR-190b抑制劑組

表5 各組SK-NEP-1細胞中PTEN、PI3K蛋白相對表達量及p-AKT/AKT的比較(n=3)

3 討論

腎母細胞瘤是一種好發于兒童的胚胎性惡性腫瘤，是小兒外科手術中最常見的惡性實體瘤。盡管其診斷和治療的技術手段已迅速發展，但現有方法僅適用于具有一定腫瘤體積的患兒。隨著生物學標記的發現，miRNA被鑒定為多種癌癥的調節劑和標記物[7]。miRNA是一種非編碼RNA，可以與目標基因的3’UTR特異性結合，從而導致目標蛋白表達水平的降低。miRNA可以作為幾種癌癥的診斷和預后生物標志物，也可以作為腫瘤生物學治療的潛在靶標[8]。已知，miR-140-5p通過直接靶向TGFBR1基因來緩解腎母細胞瘤的侵襲性發展[9]；miR-613通過靶向FRS2減弱腎母細胞瘤的增殖、遷移和侵襲[10]。miR-192、miR-194、miR-215、miR-200c和miR-141通過靶向WT9-14中的特定癌基因來抑制腫瘤的生長和進展[11]。miR-190b已被證實是一種致癌基因，可在多種癌癥中促進腫瘤的發生和發展。在人類肝細胞癌中，miR-190b通過IGF-1誘導胰島素抵抗[12]。本研究發現，在腎母細胞瘤組織中miR-190b高表達，與上述文獻報道一致；且過表達miR-190b可促進腎母細胞瘤細胞的增殖、遷移、侵襲能力，抑制細胞凋亡；敲低miR-190b表達可抑制腎母細胞瘤細胞的增殖、遷移、侵襲能力，促進細胞凋亡。因此，miR-190b可能調控腎母細胞瘤細胞的生物學行為。

研究[13]表明，PTEN/PI3K/AKT信號通路與惡性細胞的生長、增殖、遷移和侵襲密切相關。PTEN為抑癌基因，且是miR-190b的靶標，miR-190b可能通過負調控PTEN在神經膠質瘤的發生中發揮致癌作用[14]。而且PTEN/PI3K/AKT途徑被認為是肝癌侵襲和轉移的診斷和預后指標以及肝細胞癌的治療靶標[15]。在本實驗中我們發現，PTEN是miR-190b的靶基因，且miR-190b負調控PTEN的表達，促進腎母細胞瘤的增殖。

綜上所述，miR-190b通過調節PTEN/PI3K/AKT信號通路來促進腎母細胞瘤細胞的增殖、遷移、侵襲能力，抑制其凋亡。