肺鱗癌LC-42及腺癌SELS細胞中PDHA1及GBP1表達的測定

曹 靜，曾憲旭，雷冬梅，朱超亞，張歡歡，杜艷敏

鄭州大學第三附屬醫院病理科 鄭州 450052

正常細胞糖代謝是無氧糖酵解和有氧氧化磷酸化。腫瘤細胞在有氧情況下也選擇糖酵解代謝，即使氧含量充足條件下，也偏于糖酵解代謝，這種現象稱為Warburg效應[1]。丙酮酸脫氫酶E1α亞單位(pyruvate dehydrogenase E1α subunit，PDHA1)可以促使有氧糖酵解轉變為氧化磷酸化，對腫瘤形成能起到抑制作用[2]。在糖代謝過程中，鳥苷酸結合蛋白1(guanylate-binding protein 1，GBP1)也起著一定調節作用，在炎性因子干擾素-γ誘導下產生，可發揮一定抗炎作用，尤其抗病毒、寄生蟲效果明顯[3]。目前，關于GBP1和腫瘤的相關性已經受到關注，不過已有的研究[4]集中在食管癌、結腸癌方面。PDHA1及GBP1在肺鱗癌及腺癌發生發展中的分子機制是當前此領域的研究重點。本課題組[5]以往對肺鱗癌及腺癌組織切片的免疫組化研究發現，PDHA1蛋白的低表達以及GBP1蛋白的高表達和肺鱗癌及腺癌患者的病情進展密切相關。本研究旨在明確肺鱗癌及腺癌細胞系中這兩種基因表達的相互關系。

1 材料與方法

1.1細胞系肺鱗癌細胞株LC-42、肺腺癌細胞株SELS均為挪威奧斯陸大學腫瘤研究實驗室凍存株。

1.2主要試劑siRNA及相應試劑選擇Santa Cruz Biotechnology公司產品，包括GBP1 siRNA、PDHA1 siRNA、細胞轉染培養液、轉染試劑、轉染對照siRNA(37007)?？贵w：PDHA1(C54G1)系Cell Signaling Technology公司生產，GBP1(4D1O)系Novus Biologicals公司生產。

1.3細胞分組及處理兩種細胞均6孔培養板培養至70%細胞融合后分為4組?？瞻讓φ?CT)組：不轉染，用含胎牛血清的RPMI 1640培養48 h；siRNA對照(siRNA CT)組：轉染對照siRNA 6 h，含胎牛血清的RPMI 1640再培養48 h；PDHA1 siRNA組：沉默PDHA1基因的轉染混合液培養6 h，含胎牛血清的RPMI 1640再培養48 h；GBP1 siRNA組：沉默GBP1基因的轉染混合液培養6 h，含胎牛血清的RPMI 1640再培養48 h。收集各組細胞用于后續實驗。

1.4PDHA1與GBP1mRNA表達的RT-PCR檢測兩種細胞基因沉默后培養48 h，提取RNA，根據TaKaRa反轉錄試劑盒說明反轉錄合成cDNA。引物序列(表1)來源于NCBI數據庫，經Primer Premier 5.0軟件設計及BLAST檢測其特異性，由TAG Copenhagen A/S公司合成。冰上配制反應體系：Template DNA/cDNA 2 μL，RNase-free ddH2O 10 μL，10×Buffer 3.0 μL，Taq 0.2 μL，dNTP 2.4 μL，上下游引物各1.0 μL。PCR反應條件： 94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個周期，最后72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。實驗重復6次。

表1 引物序列

1.5PDHA1與 GBP1蛋白免疫細胞化學染色檢測采用EnVision二步法。分組培養48 h，胰蛋白酶消化細胞，體積分數4%中性甲醛固定，石蠟包埋細胞沉渣，包裹細胞團塊加入到脫水盒內，然后按照次序梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、切片。白片經脫蠟水化，微波爐加熱100 ℃10 min抗原修復，體積分數3%H2O2阻斷非特異性染色10 min，滴加50 μL PDHA1及GBP1抗體(稀釋度1∶100)室溫孵育1 h，PBS洗滌5 min×3次，滴加50 μL EnVision/HRP二抗室溫孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次，DAB顯色5 min，蘇木精復染3 min，最后脫水透明及封片。設置陰性及陽性兩種對照，即相同濃度且與相應抗體同源的非免疫性球蛋白作為陰性對照，已知的PDHA1陽性及GBP1陽性表達的食管鱗癌切片作為陽性對照。結果判讀：PDHA1及GBP1蛋白陽性表達呈棕黃色，均定位于胞漿，計數10個高倍視野，計算陽性細胞所占百分比。實驗重復6次。

1.6PDHA1與GBP1蛋白表達的Western blot檢測轉染細胞后培養48 h收集細胞，加入150 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃15 000 r/min離心5 min,抽上清分裝于1 mL離心管中。Bradford法測定蛋白濃度，酶標儀595 nm處測光密度值，計算上樣緩沖液體積，配平各組蛋白量，100 ℃沸水變性5 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣體積20 μL，上樣總蛋白30 μg，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓100 V，電泳時間約3 h。轉膜電壓60 V持續2 h,PVDF膜用含50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h，PDHA1、GBP1抗體(稀釋度1∶1 000)4 ℃過夜孵育，二抗室溫孵育，洗膜及曝光。使用Image J軟件進行灰度值分析，以目的蛋白與內參(GAPDH)條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復6次。

1.7統計學處理采用SPSS 19.0進行數據分析。不同組間PDHA1及GBP1 mRNA、蛋白相對表達量及蛋白陽性細胞百分比的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組PDHA1和GBP1mRNA表達的比較與CT組相比，PDHA1 siRNA組PDHA1 mRNA表達水平下降，而GBP1 mRNA表達水平升高；GBP1 siRNA組GBP1 mRNA表達水平下降，PDHA1 mRNA表達水平無變化。見圖1、2，表2。

1、2：CT組；3、4：siRNA CT組；5～8：PDHA1 siRNA組；9～12：GBP1 siRNA組

1、2：CT組；3、4：siRNA CT組；5～8：PDHA1 siRNA組；9～12：GBP1 siRNA組

表2 各組PDHA1及GBP1 mRNA相對表達量比較

2.2各組PDHA1和GBP1蛋白表達的比較免疫細胞化學染色(表3)及Western blot檢測(表4)結果表明，與CT組相比，PDHA1 siRNA組PDHA1蛋白表達水平下降，而GBP1蛋白表達水平增加；GBP1 siRNA組GBP1蛋白表達水平下降。

表3 各組PDHA1及GBP1蛋白陽性細胞百分比的比較 %

表4 各組PDHA1及GBP1蛋白相對表達量比較

3 討論

本課題組前期研究[5]顯示，在肺鱗癌及腺癌的臨床病理組織標本中，PDHA1低表達及GBP1高表達顯示出更具侵襲性的臨床特征和較短的總體生存期，而且PDHA1及GBP1二者的表達存在負相關性，即PDHA1高表達伴隨GBP1低表達。隨即展開了PDHA1及GBP1相互關系的研究，應用瞬時轉染方法分別沉默這兩個基因，檢測mRNA及蛋白表達。siRNA CT組與CT組比較，PDHA1和GBP1 mRNA表達水平無差異，據此判斷siRNA對照試劑不會影響基因表達，目的基因siRNA實驗結果可靠。和CT組相比，PDHA1 siRNA組肺鱗癌及腺癌細胞的PDHA1 mRNA表達水平明顯降低，但是GBP1 mRNA表達水平升高；GBP1 siRNA組的GBP1 mRNA表達水平下降，而PDHA1 mRNA表達水平無

變化。免疫細胞化學染色及Western blot檢測兩個指標的蛋白表達水平，變化趨勢與上述一致。由此可判斷出PDHA1對GBP1的轉錄和蛋白表達起到一定下調作用，且是基于轉錄水平調節的。但是，GBP1基因卻不影響PDHA1基因表達。

人體正常細胞通過線粒體氧化磷酸化和糖酵解產生能量，而癌細胞的顯著特征之一就是主要以有氧糖酵解為主，稱為Warburg效應[6]。PDHA1是Warburg效應的守門員，PDHA1表達及活性下降，則Warburg效應增強，腫瘤細胞快速分裂，更具有侵襲性[7]。

有研究[8]表明，在頭頸部鱗癌中GBP1高表達與總生存期縮短相關。膠質瘤細胞中，GBP1高表達促進細胞增殖和遷徙[9]。本課題組[10-11]近年來始終圍繞PDHA1及GBP1這兩個基因和腫瘤的關系進行研究，建立了PDHA1敲除的前列腺癌細胞系及食管鱗癌細胞系，證明了PDHA1基因敲除能促進腫瘤細胞的糖酵解，增加腫瘤細胞增殖、遷移能力和對化療的抵抗。而且，通過抗癌藥物長期誘導而使PDHA1敲除的腫瘤細胞GBP1表達提高，說明GBP1升高可能和癌細胞耐受缺氧及化療等極端環境有關。而GBP1基因敲除可以降低前列腺癌細胞的侵襲性、線粒體的氧化磷酸化及糖酵解水平[12]。今后，可用基因重組技術繼續深入研究非小細胞肺癌中兩種基因調控機制，尋找腫瘤治療的新靶點。