甲狀腺乳頭狀癌組織中Foxp3的表達

趙水英，秦貴軍，李志臻，馬曉君，孟棟棟，任高飛

鄭州大學第一附屬醫院內分泌科 鄭州 450052

甲狀腺癌是最常見的內分泌系統惡性腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是甲狀腺癌中最常見的類型，新發病例數占所有甲狀腺癌的80%～90%，且發病年齡呈現年輕化趨勢[1]。轉移是影響PTC預后的關鍵因素，約1/3患者在疾病早期出現頸部淋巴結轉移或遠處轉移[2]。因此，尋找PTC發生發展、侵襲轉移的相關分子靶點對延緩腫瘤進展、改善患者預后具有深遠意義。

叉頭狀轉錄因子3(forkhead box protein 3，Foxp3)是叉頭/翼狀螺旋轉錄因子家族中的重要成員，通過調控調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)參與免疫抑制過程[1-2]。近年來研究[3]證實，某些惡性腫瘤細胞可自身表達Foxp3，但其具體作用機制仍有待研究。BRAF V600E基因突變是PTC中最常見的遺傳學事件，是腫瘤侵襲性臨床表型和預后不佳的指標[4]。本研究通過檢測PTC組織中Foxp3的表達水平并分析其與臨床病理參數以及BRAF V600E基因突變的關系，探討Foxp3作為PTC治療靶點的潛在價值。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2019年1月至10月鄭州大學第一附屬醫院甲狀腺外科手術切除并經病理學確診的147例PTC患者的癌組織標本。147例中男42例，女105例，年齡21～63歲，其中56例多灶性PTC(24例微小PTC，41例發生淋巴結轉移)，91例單灶性PTC(49例微小PTC，38例發生淋巴結轉移)，均不合并其他甲狀腺疾病或腫瘤。癌旁正常甲狀腺組織取自69例同期手術切除組織，69例中男21例，女48例，年齡24～62歲。所有組織標本均經術中快速冰凍及術后常規病理檢查確認。本研究獲得鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會審批同意，標本采集前患者均簽署知情同意書。

1.2PTC組織及癌旁正常甲狀腺組織中Foxp3mRNA與蛋白表達的檢測

1.2.1 qRT-PCR 取液氮中冷凍新鮮組織并研磨至粉末狀，按照Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書步驟提取總RNA，反轉錄獲取cDNA，PCR擴增檢測Foxp3 mRNA。反轉錄試劑盒、PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。Foxp3上游引物：5’-CA CAACATGCGACCCCCTTTCACC-3’，下游引物：5’-AGGTTGTGGCGGATGGCGTTCTTC-3’，β-actin上游引物：5’-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3’，下游引物：5’-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGCC-3’。反應體系：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，ROXⅡ 0.4 μL，SYPR Green Master Mix 10 μL,ddH2O 6.8 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算Foxp3 mRNA表達水平。每組設置3個復孔，實驗結果重復3次，計算平均值。

1.2.2 免疫組化染色 標本經40 g/L多聚甲醛固定，組織脫水，石蠟包埋，4～ 5 μm厚切片，按照SP試劑盒說明書進行免疫組化染色，光鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知染色陽性的大鼠脾臟組織作為陽性對照。結果評定標準：每張切片選取5個視野(×400)，參照Shu等[5]的研究，根據染色強度和陽性細胞百分比分別評分。染色強度：無明顯著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細胞百分比：無反應性0分，<5%為1分，5%～50%為2分，>50%為3分。最后兩項得分相加，陰性(0分)和弱陽性(1～2分)為低表達，陽性(3分)和強陽性(4～ 6分)為高表達。

1.3BRAF V600E基因型分析提取癌組織DNA。上游引物：5’-TCATAATGCTTGCTCTGATAG GA-3’，下游引物：5’-GGCCAAAAATTTAATCAGTG GA-3’，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴增BRAF V600E目的基因片段，擴增片段長度224 bp，測序儀檢測BRAF基因突變情況。

1.4統計學處理應用SPSS 17.0處理數據。采用兩獨立樣本t檢驗比較PTC組織和癌旁正常甲狀腺組織以及不同臨床病理特征的PTC患者癌組織中Foxp3 mRNA表達水平的差異，采用χ2檢驗比較PTC組織和癌旁正常甲狀腺組織Foxp3蛋白的高表達率及Foxp3高、低表達組間BRAF V600E基因型突變率的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1Foxp3mRNA在PTC及癌旁正常甲狀腺組織中的表達Foxp3 mRNA在PTC組織中的表達水平(2.57±0.84)高于癌旁正常甲狀腺組織(1.00±0.35)(t=2.950，P=0.004)，并且與腫瘤TNM分期，有無包膜、脈管侵犯及淋巴結轉移有關(P<0.05)，而與患者年齡、性別、腫瘤大小及是否多灶性無關(P>0.05)，見表1。

表1 不同臨床病理特征PTC患者Foxp3 mRNA表達水平的比較

2.2PTC組織和癌旁正常甲狀腺組織中Foxp3蛋白的表達及定位結果見圖1和表2。PTC組織中Foxp3蛋白高表達，散在或局灶性表達于癌細胞的胞核、胞漿，腫瘤間質浸潤的淋巴細胞中Foxp3蛋白亦呈陽性表達，而多數癌旁正常甲狀腺組織中Foxp3蛋白呈陰性表達，僅少數可見上皮細胞胞漿中呈陽性表達。PTC組織中Foxp3蛋白高表達率高于癌旁正常甲狀腺組織。

A:Foxp3在PTC細胞胞漿和胞核共表達；B：癌旁正常甲狀腺上皮細胞Foxp3陰性表達；C:腫瘤間質浸潤的淋巴細胞中Foxp3的表達

表2 PTC和癌旁正常甲狀腺組織中Foxp3蛋白表達的比較

2.3不同Foxp3蛋白表達水平的PTC組織中BRAF V600E基因型突變情況結果顯示，Foxp3蛋白高表達者BRAF V600E基因型突變率[68.0%(34/50)]高于低表達者[47.4%(46/97)](χ2=5.632，P=0.018)。

3 討論

近年來PTC發病率不斷攀升，雖絕大多數患者能通過手術和131I治療獲得治愈，但仍有10%的患者因低分化和進展期腫瘤而死亡[6]。探討影響PTC侵襲轉移的分子靶點及治療手段是目前面臨的重要課題。惡性腫瘤的發生發展與機體的免疫功能密切相關。CD4+CD25+調節性T細胞即Treg細胞，與自身免疫性疾病和腫瘤的發生發展密切相關[7-8]。Foxp3在Treg細胞分化發育、維持機體免疫耐受和免疫應答穩態等方面發揮重要作用[9]。近年來研究[3]證實，包括PTC在內的某些惡性腫瘤細胞表達Foxp3，但Foxp3在PTC細胞內定位及與患者臨床病理特征的關系的報道不盡相同，有必要進一步深入研究。本研究選取不合并其他甲狀腺疾病或其他腫瘤的PTC患者為研究對象，結果顯示，與癌旁正常甲狀腺組織相比，PTC組織中Foxp3 mRNA和蛋白的表達升高，與文獻[10-11]報道一致。進一步分析Foxp3 mRNA表達水平與PTC患者臨床病理特征之間的關系發現，Foxp3 mRNA與PTC患者TNM分期，有無脈管、包膜侵犯及淋巴結轉移有關，提示Foxp3與PTC的發生發展有關。

Foxp3可通過調控一些抗炎因子如IL-10、TGF-β等的含量發揮免疫抑制功能，此外機體內有上千種蛋白的表達也受其調控[12-13]。據研究[14]，某些腫瘤細胞表達的Foxp3具有類似Treg細胞中的免疫抑制功能。在非小細胞肺癌細胞中，Foxp3與β-catenin和TCF4相互作用，激活Wnt/β-catenin信號傳導通路，促進腫瘤EMT過程和轉移[15]。目前Foxp3在PTC細胞的具體作用機制還有待進一步闡明。

本研究還發現，癌旁正常甲狀腺組織僅少數上皮細胞胞漿內存在Foxp3蛋白表達，而PTC細胞Foxp3蛋白表達增強且多為核漿彌漫共表達，以胞核表達為主。蛋白的定位與功能密切相關，但PTC細胞中Foxp3的亞細胞定位目前的研究結果并不一致。Ugolini等[10]研究認為PTC細胞Foxp3的表達以胞漿為主，其次為核漿共表達和單純核表達。Cunha等[11]認為分化型甲狀腺癌細胞中Foxp3的定位模式為胞核表達多于胞漿。PTC細胞Foxp3的亞細胞定位及形成機制有待進一步擴大樣本量或進行更深入的研究。

此外，本研究分析了PTC組織中Foxp3蛋白表達水平與BRAF V600E基因突變的關系，發現Foxp3高表達者BRAF V600E突變率高于Foxp3低表達者。BRAF V600E是PTC患者最常見的基因突變，與腫瘤的高侵襲性、淋巴結轉移、高臨床分期(Ⅲ～Ⅳ期)及易復發性相關[4-16]。BRAF V600E突變與Foxp3表達的關系還有待進一步的分子生物學研究及大樣本量的臨床病例資料分析證實。

綜上所述，Foxp3 mRNA在PTC組織中表達增高，且與TNM分期，有無包膜、脈管侵犯及淋巴結轉移有關；Foxp3蛋白細胞內定位模式與正常甲狀腺上皮細胞中不同，同時Foxp3蛋白高表達者BRAF V600E突變率更高；以上均提示，Foxp3可能參與了PTC的發生發展。本研究為闡明PTC侵襲轉移的機制提供了新思路，也為PTC的治療提供了新的靶點。