新型靶向人源BCMA 的CAR-T 細胞構(gòu)建及其對BCMA陽性腫瘤細胞的殺傷作用觀察

尚鳳琴，李曉瑞，余卓營，張野，石冰潔，王建勛

北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京102488

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種以克隆性漿細胞積聚為特征的惡性腫瘤［1］，目前MM 的治療主要依靠四類藥物，即蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、單抗類藥物以及糖皮質(zhì)激素。近年來雖然蛋白酶體抑制劑硼替佐米與免疫調(diào)節(jié)劑來那度胺聯(lián)合治療MM 已經(jīng)取得了較好的效果，但仍無法改善患者的預后［2-4］。B 細胞成熟抗原（BCMA）是腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族成員，選擇性表達于終末分化的包括MM腫瘤細胞在內(nèi)的 B 淋巴細胞表面［5］。BCMA 主要在漿細胞上表達，在人體主要器官的細胞上基本不表達［6-9］。嵌合抗原受體（CAR）是結(jié)合抗原識別域、共刺激域和 T 細胞激活域的一種蛋白［10-11］。BCMA 是CAR-T 細胞治療MM 的一個理想靶抗原，經(jīng)過改造的CAR-T 細胞能夠特異性識別并消除表達靶向抗原的腫瘤細胞［9］。2019年3月—2020年1月，我們設計了一種新型靶向人源BCMA 的CAR 分子，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導健康志愿者的T 細胞，成功制備Anti-BCMA-CAR-T 細胞，并觀察其對BCMA 陽性腫瘤細胞的殺傷作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：逆病毒包裝細胞系以及人慢性髓系白血病細胞K562、人BCMA 陽性 K562（K562-hB?CMA）細胞、食蟹猴BCMA 陽性K562（K562-cBCMA）細胞、人骨髓瘤B 細胞RPMI-8226 細胞系均購自美國ATCC 細胞庫。主要試劑：RPMI 1640 培養(yǎng)基、AIM-Ⅴ培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）及PBS 緩沖液均購自美國Gibco 公司，熒光素酶底物、FuGene HD 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Promega 公司，淋巴細胞分離液、細胞凋亡試劑盒均購自北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司，白細胞介素2（IL-2）、OKT-3 購自北京義翹神州科技股份有限公司，干擾素γ（IFN-γ）ELISA 試劑盒購自美國 R&D 公司，Myc-PE、BCMA-BV421、CD3-APC等抗體均購自美國BD公司。

1.2 靶向人源BCMA 的CAR（BCMA-CAR）分子構(gòu)建 實驗室前期通過噬菌體展示技術(shù)篩選出親和力較強的Anti-BCMA-CAR，再由通用生物公司合成BCMA ScFv 序列，由此構(gòu)建靶向人源BCMA 的CAR分子，其結(jié)構(gòu)為經(jīng)典第二代CAR 分子結(jié)構(gòu)，將BC?MA ScFv、CD8 鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD28 胞內(nèi)區(qū)和CD3ζ胞內(nèi)區(qū)依次串聯(lián)，具體分子結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 CAR分子結(jié)構(gòu)示意圖

1.3 pMFG-Myc-BCMA-CAR 質(zhì)粒載體構(gòu)建 合成BCMA ScFv 序列后，將序列與載體由XhoⅠ/NotⅠ雙酶切，凝膠電泳的方式回收酶切后的目的片段與載體并純化，16 ℃條件下將純化后的目的片段與載體用T4 連接酶連接1 h。用DH-5α 感受態(tài)進行轉(zhuǎn)化，挑取單克隆加入有氨芐抗性的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃搖床孵育12～16 h。提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定正確后進行測序，測序正確的質(zhì)粒載體被命名為pMFG-Myc-BCMA-CAR。

1.4 T細胞制備及分組轉(zhuǎn)導 抽取3位健康志愿者外周血各20 mL，采用Ficoll 密度梯度離心法分離單個核細胞（PBMC），重懸于AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基（添加10% FBS 和1%青—鏈霉素溶液），同時加入終濃度為100 ng/mL OKT-3和100 U/mL IL-2刺激T細胞增殖，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。收集培養(yǎng)后的細胞即為人原代T 細胞，分為觀察組和對照組。觀察組將pMFG-Myc-BCMA-CAR 質(zhì)粒載體包裝為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并進行轉(zhuǎn)導，對照組不做轉(zhuǎn)導處理。轉(zhuǎn)導48 h 后用Myc-PE 抗體通過流式細胞術(shù)檢測Myc抗原表達，計算轉(zhuǎn)導效率（即Myc表達率）。轉(zhuǎn)導效率＝Myc-PE 陽性細胞數(shù)/總活細胞數(shù)×100%。

1.5 細胞增殖能力觀察 取兩組細胞，以提取PBMC 當天記為第 0 天，之后每2 天（48 h）計數(shù)傳代1 次，維持細胞密度為 1×106/mL、IL-2 終濃度為 100 U/mL。單次生長倍數(shù)為計數(shù)時細胞密度與上次處理時細胞終密度的比值，生長倍數(shù)為單次生長倍數(shù)的乘積，第0 天單次生長倍數(shù)和生長倍數(shù)均定為1。分別計算兩組培養(yǎng)0～18 d的生長倍數(shù)對數(shù)值，并繪制增殖曲線。

1.6 兩組細胞與RPMI-8226 細胞共培養(yǎng)時的體外增殖能力觀察 采用CFSE 染色的T細胞增殖實驗。從液氮中取出并復蘇RPMI-8226 細胞，以1×106/mL接種于RPMI 1640 完全培養(yǎng)基（添加10%FBS 和1%青—鏈霉素溶液），37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。每隔48 h 計數(shù)傳代1 次，觀察細胞狀態(tài)，當RPMI-8226細胞存活率達到80%以上時表示細胞狀態(tài)良好，可以進行后續(xù)實驗。將RPMI-8226 細胞用AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基（含IL-2）稀釋至4×104/100 μL，取100μL接種于96孔板實驗孔。取兩組細胞，采用CFSE（用AIM-Ⅴ培養(yǎng)基稀釋成10 μmol/mL）37 ℃水浴避光染色處理；調(diào)整細胞密度為1×104/100μL，取100μL 加在鋪有RPMI-8226 細胞的孔中，即效靶比為1∶4。放入培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)72 h，上流式細胞儀，CD3-APC染色標記T細胞，以CFSE現(xiàn)染（0 h）的T細胞作為陽性對照。通過CFSE 信號強弱比較兩組共培養(yǎng)后的細胞增殖情況，CFSE 信號越弱（左移越明顯）表明其增殖能力越強。

1.7 兩組細胞對靶細胞的殺傷能力觀察

1.7.1 兩組細胞對BCMA 陽性腫瘤細胞的殺傷能力觀察 ①采用流式細胞術(shù)。參照1.6 的方法培養(yǎng)RPMI-8226、K562細胞，用BCMA-BV421抗體通過流式細胞術(shù)檢測其細胞表面BCMA 陽性率，結(jié)果顯示分別為44.7%、0.4%，選擇RPMI-8226 作為細胞殺傷的靶細胞。將兩組細胞制備細胞懸液，參照1.6的方法進行實驗鋪板，與RPMI-8226 細胞以不同效靶比（1∶4、1∶1、4∶1，4×104/100 μL 靶細胞為 1∶1）共孵育（作為殺傷孔），并以僅有RPMI-8226 細胞的孔作為未殺傷孔；12 h 后300 g 離心5 min，收集細胞。染色緩沖液（含10% FBS 的PBS 緩沖液）沖洗1 遍，CD3-APC染色60 min，沖洗后重懸于配好的Annexin-Ⅴ-FITC緩沖液中，45 min后終止染色。用流式細胞儀檢測靶細胞凋亡率，其中APC 陰性（靶細胞）且FITC 陽性（凋亡細胞）區(qū)域細胞為凋亡細胞。殺傷效率=殺傷孔靶細胞凋亡率-未殺傷孔靶細胞凋亡率。②采用熒光素酶化學發(fā)光實驗。將兩組細胞制備細胞懸液，參照1.6 的方法進行實驗鋪板，與RPMI-8226 細胞以不同效靶比（1∶4、1∶1、4∶1，4×104/100μL 靶細胞為1∶1）共孵育（作為實驗孔），以僅有RPMI-8226 細胞的孔作為最大釋放孔，以只有培養(yǎng)基的孔作為空白孔。12 h 后300 g 離心5min 去除上清，1×PBS緩沖液沖洗掉效應細胞，加入配制好的ONE-GloTM試劑，室溫避光放置5 min。設置化學發(fā)光模式（LUM）、全白酶標板、震板10 s、PMT=500。計算殺傷效率，殺傷效率=1-（實驗孔細胞凋亡率-空白孔細胞凋亡率）/（最大釋放孔細胞凋亡率-空白孔細胞凋亡率）×100%。

1.7.2 兩組細胞對人BCMA 陽性腫瘤細胞的特異性殺傷能力觀察 采用流式細胞術(shù)。將K562-cBC?MA、K562-hBCMA 細胞接種于 RPMI 1640 培養(yǎng)基（添加10% FBS 和1%青—鏈霉素溶液），調(diào)整細胞密度為1×106/mL，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。參照1.7.1 用BCMA-BV421 抗體通過流式細胞術(shù)檢測K562-cBCMA、K562-hBCMA 細胞表面人BCMA 陽性率，結(jié)果顯示分別為0.2%、73.9%。將兩組細胞制備細胞懸液，分別與K562-cBCMA、K562-hBCMA 細胞以不同效靶比（1∶4、1∶1、4∶1，4×104/100 μL 靶細胞為1∶1）共孵育12 h。參照1.7.1采用流式細胞術(shù)檢測殺傷效率。

1.8 兩組細胞殺傷BCMA 陽性腫瘤細胞后上清IFN-γ 水平檢測 采用ELISA 法。將兩組細胞與RPMI-8226、K562-hBCMA 兩種 BCMA 陽性腫瘤細胞分別共培養(yǎng)12 h，效靶比為4∶1（4×104/100 μL靶細胞為 1∶1）。收集細胞后 300 g 離心 5 min，吸取細胞上清，采用ELISA法檢測上清IFN-γ 水平。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組轉(zhuǎn)導效率比較 觀察組和對照組轉(zhuǎn)導效率分別為44.83%、0.03%。見圖2。

2.2 兩組細胞增殖能力比較 兩組培養(yǎng)0～18 d的生長倍數(shù)對數(shù)值比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見圖3。

2.3 兩組細胞與RPMI-8226 細胞共培養(yǎng)時的體外增殖能力比較 與對照組比較，觀察組FITC 信號明顯左移。見圖4。

2.4 兩組細胞在不同效靶比時對RPMI-8226 細胞的殺傷效率比較 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，相同效靶比時，觀察組殺傷效率均高于對照組（P均＜0.05）。熒光素酶化學發(fā)光實驗結(jié)果顯示，效靶比為1∶1、4∶1 時，觀察組殺傷效率均高于對照組（P均＜0.05）；效靶比為1∶4 時，觀察組與對照組殺傷效率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

圖2 Anti-BCMA-CAR-T細胞與普通T細胞的轉(zhuǎn)導效率圖

圖3 兩組培養(yǎng)0～18 d細胞增殖曲線

圖4 兩組細胞與RPMI-8226細胞共培養(yǎng)時的體外增殖情況

表1 兩組細胞在不同效靶比時對RPMI-8226細胞的殺傷效率比較（%，±s）

表1 兩組細胞在不同效靶比時對RPMI-8226細胞的殺傷效率比較（%，±s）

注：與對照組相同效靶比比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別觀察組效靶比1∶4效靶比1∶1效靶比4∶1對照組效靶比1∶4效靶比1∶1效靶比4∶1殺傷效率流式細胞術(shù)16.67±12.24*41.90± 5.42**65.05±12.06**2.53± 1.35 6.50± 3.34 17.21± 7.88熒光素酶化學發(fā)光實驗39.45±12.94 74.04±10.87**97.63± 2.57**21.01±14.43 26.65±15.90 49.98±11.48

2.5 兩組細胞在不同效靶比時對K562-cBCMA、K562-hBCMA 細胞的殺傷效率比較 效靶比為1∶4時，兩組細胞對K562-cBCMA、K562-hBCMA 細胞的殺傷效率比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）；效靶比為 1∶1、4∶1 時，觀察組細胞對 K562-hBCMA 細胞的殺傷效率明顯高于同組K562-cBCMA 及對照組對K562-hBCMA的殺傷效率（P均＜0.05）。見表2。

2.6 兩組細胞殺傷RPMI-8226、K562-hBCMA 細胞后上清IFN-γ 水平檢測 在殺傷相同BCMA 陽性靶細胞后，觀察組上清IFN-γ水平均高于對照組（P均＜0.05）。見表3。

表2 兩組細胞在不同效靶比時對K562-cBCMA、K562-hBCMA細胞的殺傷效率比較（%，±s）

表2 兩組細胞在不同效靶比時對K562-cBCMA、K562-hBCMA細胞的殺傷效率比較（%，±s）

注：與同組相同效靶比殺傷K562-cBCMA比較，*P＜0.05；與對照組相同效靶比殺傷相同靶細胞比較，#P＜0.05。

組別觀察組效靶比1∶4效靶比1∶1效靶比4∶1對照組效靶比1∶4效靶比1∶1效靶比4∶1殺傷效率K562-cBCMA 0.52±2.69 2.86±1.94 3.29±3.85 1.45±0.92 2.24±1.11 5.70±4.84 K562-hBCMA 2.51±0.59 11.82±3.47*#34.03±8.63*#0.27±1.43 1.17±1.37 4.48±1.50

表3 兩組細胞殺傷RPMI-8226、K562-hBCMA細胞后上清IFN-γ水平（pg/mL，-x± s）

3 討論

MM 是一種以克隆性漿細胞積聚為特征的惡性腫瘤［1］，主要表現(xiàn)為骨髓中漿細胞惡性增生、分泌大量單克隆免疫球蛋白（M 蛋白），并最終導致靶器官損害［12］。近年來，自體造血干細胞移植的方法得到推廣，患者生存率也得到了顯著提升，但是目前MM仍是一種不可治愈的疾病［13］。幾乎所有的MM 患者最終都會復發(fā)或產(chǎn)生耐藥性，而MM 的藥物治療效果會隨著病情的反復而逐漸減弱。隨著CAR-T 細胞在急性淋巴細胞白血病治療中獲得成功，其在MM 中的研究也陸續(xù)開展。目前運用CAR-T 細胞治療 MM 的主要靶點有 CD38、BCMA、CS1（SLAMF7）等［14］，其中 BCMA 基本上只在漿細胞上表達，是CAR-T 細胞治療 MM 的理想靶抗原［9］。靶向 BCMA的CAR-T 細胞bb2121 已在MM 的治療中得到應用［15］。

目前，Anti-BCMA-CAR-T 細胞靶向治療 MM 已經(jīng)取得了一定進展［16-17］。本研究采用的CAR 分子結(jié)構(gòu)為第二代結(jié)構(gòu)，共刺激分子為CD28，用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進行包裝并成功轉(zhuǎn)染人原代T 細胞，成功構(gòu)建Anti-BCMA-CAR-T 細胞。本研究結(jié)果顯示，兩組培養(yǎng)0～18 d 的生長倍數(shù)對數(shù)值比較差異均無統(tǒng)計學意義，體外增殖實驗結(jié)果顯示觀察組FITC 信號明顯左移；提示Anti-BCMA-CAR 在轉(zhuǎn)染T 細胞后對T細胞的增殖沒有明顯影響，但是與RPMI-8226 細胞共培養(yǎng)時的體外增殖能力明顯升高，表明我們構(gòu)建的CAR分子可以有效增強T細胞的增殖能力。為了驗證Anti-BCMA-CAR-T細胞殺傷BCMA陽性腫瘤細胞的能力和特異性，本研究選用了多種BCMA 陽性表達的細胞模型，即RPMI-8226、K562-hBCMA、K562-cBCMA 等。結(jié)果顯示，效靶比為 1∶1、4∶1 時，觀察組對RPMI-8226、K562-hBCMA 細胞的殺傷效率均高于對照組，但兩組細胞在相同效靶比時對K562-cBCMA 細胞的殺傷效率比較差異均無統(tǒng)計學意義；提示Anti-BCMA-CAR-T 細胞可特異性殺傷BCMA 陽性腫瘤細胞，且對人BCMA 陽性靶細胞具有殺傷特異性。

T 細胞與腫瘤細胞發(fā)生反應的一個關鍵特征是效應分子的釋放，其中就包括促炎癥細胞因子IFN-γ 的釋放［18］。因此，檢測 IFN-γ 的分泌情況可以從側(cè)面驗證T 細胞對腫瘤細胞的殺傷效率。本研究結(jié)果顯示，在殺傷相同BCMA 陽性靶細胞后，觀察組上清IFN-γ 水平均高于對照組，觀察組上清 IFN-γ 為 200～1 500 pg/mL；說明我們構(gòu)建的Anti-BCMA-CAR-T 細胞的殺傷能力可以被BCMA抗原激活，并釋放大量殺傷性相關細胞因子IFN-γ。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了一種新型靶向人源BCMA 的CAR-T 細胞，該細胞能夠有效且特異性殺傷人BCMA 陽性腫瘤細胞，下一步擬進行動物實驗驗證Anti-BCMA-CAR-T 細胞在體內(nèi)對腫瘤細胞的殺傷效果。