FXYD6 過表達對肝細胞癌SMMC7721 細胞5-Fu化療敏感性的影響

陳雄飛，丁立爽，孔德帥，趙秀雷，廖麗麗，張耀敏，李鳳山，劉汝海

滄州市中心醫院，河北滄州061001

肝細胞癌是起源于肝細胞的惡性腫瘤，我國肝細胞癌患者多存在乙型病毒型肝炎病史，患者就診時多屬中晚期，根治性切除手術成功率低，術后復發率高［1-2］。肝細胞癌通常為富血供腫瘤，腫瘤供血動脈主要是肝動脈，經肝動脈化療栓塞（TACE）是肝細胞癌術后重要的輔助治療手段［3］，也是中晚期肝細胞癌患者的重要治療方法［4］。5-氟尿嘧啶（5-Fu）是細胞周期特異性藥物，在細胞內轉化為有效的5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸后，通過阻斷胸腺嘧啶核苷酸合成酶而干擾DNA 的合成，主要應用于消化道腫瘤和實體腫瘤的化療。肝細胞癌細胞的異質性及耐藥性可導致其對5-Fu 的敏感性降低，這與肝細胞癌差異表達耐藥相關蛋白有關。離子通道相關蛋白在腫瘤進展的分子網絡調控中具有重要作用，與腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性相關。FXYD 離子轉運調節因子6（FXYD6）是鈉鉀泵的重要調節亞基，也是腫瘤相關蛋白，在多種惡性腫瘤中呈高表達［5-8］。前期研究發現，FXYD6 蛋白在肝細胞癌組織中呈高表達，在體外可通過上調鈉鉀泵的α1亞基，激活其下游Src-ERK 信號傳導通路，從而促進肝細胞癌細胞的增殖與轉移［6］。目前，FXYD6 蛋白在肝細胞癌細胞中的表達變化及其對細胞化療敏感性的影響鮮見報道。為此，我們于 2019 年 4 月—2020 年 3 月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：肝細胞癌細胞系HepG2、SNU449、Huh-7、SMMC7721 及人正常肝細胞 HL-7702（L-02）均購自美國 ATCC 細胞庫。質粒：對照空載體真核表達質粒pcDNATM3.1/Vector 購自日本TaKaRa 公司，真核表達質粒pcDNATM3.1/FXYD6 為前期制備［9］。主要試劑：LipofectamineTM2000 轉染試劑購自美國Invitrogen 公司，胰蛋白酶、青—鏈霉素混合液購自美國Gibco 公司，鼠抗hFXYD6 單克隆抗體為前期制備［10］；Western blot Kit高靈敏度化學發光檢測試劑盒購自北京康為世紀生物有限公司，HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 購自北京索萊寶科技有限公司，MTT 檢測試劑盒、GAPDH 單克隆抗體、Caspase-3 單克隆抗體均購自英國Abcam公司，Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 肝細胞癌細胞的篩選 采用Western blotting法 。 取 對 數 生 長 期 的 HepG2、SNU449、Huh-7、SMMC7721及對照L-02細胞，加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白。進行SDS-PAGE 電泳，15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上；分別加入FXYD6、GAPDH 一抗（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶2 000），室溫孵育1 h，PBST清洗3次；加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵化45 min，PBST 清洗 3 次。以 GAPDH 為內參，采用 Western blot Kit 高靈敏度化學發光檢測試劑盒檢測目的蛋白條帶。結果顯示，FXYD6蛋白在HepG2、SNU449、Huh-7 細胞中高表達，而在SMMC7721 細胞和對照L-02 細胞中低表達或不表達，見圖1。因SMCC7721低表達FXYD6 蛋白，故選取SMMC7721 細胞進行后續實驗。

圖1 FXYD6蛋白在肝細胞癌細胞系及對照L-02細胞中的表達條帶圖（Western blotting法）

1.3 細胞分組與轉染處理 將肝細胞癌SMMC7721細胞在RPMI 1640 培養液中常規培養，待培養至對數生長期，用0.25%胰蛋白酶消化，以3×105/孔接種于4 孔板中，加入完全培養液。待細胞融合度達80%，隨機分為過表達組和對照組。過表達組和對照組分別加入100 μL 無血清RPMI 1640 培養液稀釋的 pcDNA3.1/FXYD6、pcDNA3.1/Vector 真核質粒（各2 μg），加入轉染試劑LipofectamineTM2000 溶液10 μL，輕輕混勻。室溫孵育30 min，用無血清RPMI 1640 培養液洗滌細胞，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養液。培養48 h 后加入2 mg/mL 含G418 的完全培養液篩選陽性克隆，待克隆形成后，分別挑選質粒轉染后的SMMC7721 抗性克隆，并擴大培養。

1.4 細胞增殖能力觀察 采用MTT 法。取兩組轉染后的抗性克隆細胞，胰酶消化后，以5×103/孔接種于 96 孔板中，分別加入終濃度為 0、12.5、25、50、100 μg/mL 的5-Fu 100 μL，在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養24、36、48 h。每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續培養4 h；棄孔內液體，加入150 μL二甲基亞砜，脫色搖床振蕩10 min，使結晶物充分溶解，在 2500 型 BIO-RAD 酶標儀上檢測 490 nm 處的光密度（OD）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗孔OD 值）/對照孔OD 值×100%。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.5 細胞凋亡能力觀察 采用流式細胞術。取兩組轉染后的細胞，胰酶消化后，以5×103/孔接種于6孔板中，繼續培養24 h，并加入終濃度為25μg/L 的5-Fu作用48 h。干預結束后，用70%乙醇固定細胞，并根據試劑盒說明書操作步驟進行Annexin V 及PI染色。避光孵育15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較和組內比較分別采用成組t檢驗和配對t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組經不同濃度5-Fu作用后的細胞增殖抑制率比較 隨著5-Fu濃度增加和作用時間延長，兩組細胞增殖抑制率均呈升高趨勢。5-Fu濃度為12.5μg/mL時，兩組作用24、36、48 h的細胞增殖抑制率比較均無明顯差異（P均＞0.05）；5-Fu濃度為25、50、100μg/mL時，過表達組作用24、36、48 h 的細胞增殖抑制率均明顯低于對照組同時間點（P均＜0.01）。見表1。

表1 兩組經不同濃度5-Fu作用后的細胞增殖抑制率比較（-x± s）

2.2 兩組細胞凋亡率比較 觀察組細胞凋亡率為35.62% ± 3.98%，對照組為46.19% ± 6.60%，兩組比較P＜0.01。

3 討論

乙型肝炎病毒感染是導致肝細胞癌變最主要的原因，絕大部分患者感染乙型肝炎病毒后，肝內纖維結締組織異常增生長導致肝硬化的發生，最終發展為肝細胞癌［11-12］。肝細胞癌起病隱匿，早期就診率低，根治性切除率低，根治性切除術后5年復發率高達70%［13］。目前化療是肝細胞癌治療的一個輔助手段，5-Fu 是局部或全身化療過程中常用的化療藥物，可通過阻斷胸腺嘧啶合成，誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡。研究顯示，以5-Fu 為基礎的化療方案在晚期肝細胞癌患者的腫瘤反應和生存方面顯示出一定優勢［14］。但很多肝細胞癌患者對5-Fu 天然耐藥或在治療過程中產生耐藥，導致5-Fu 化療效果降低，引起肝細胞癌復發和轉移，是化療失敗的主要原因，這與肝細胞癌藥物治療靶點缺乏和抗癌藥耐藥性增加有關［15］。因此，尋找與肝細胞癌化療耐藥相關的蛋白，將為改善肝細胞癌患者預后提供新思路。

膜轉運蛋白參與維持細胞穩態及臨床藥物耐藥性等細胞功能，已成為癌癥治療的新靶標［16］。鈉鉀泵是由不同的α 和β 亞基組成的同工酶，在維持細胞穩定性方面具有重要作用，其在細胞黏附中發揮關鍵作用，并與多種癌癥的發生和發展相關，是抗癌治療的重要靶標［17］。鈉—鉀泵抑制劑可提高傳統放、化療不敏感腫瘤的放化療敏感性［18］。FXYD6 蛋白為離子通道相關蛋白，是鈉—鉀泵的調節亞基，在維持細胞鈉、鉀離子跨膜濃度梯度方面具有重要作用。FXYD6 蛋白也是腫瘤相關蛋白，目前尚無研究表明FXYD6 差異表達與肝細胞癌耐藥相關。本研究結果顯示，FXYD6 蛋白在肝細胞癌HepG2、SNU449、Huh-7 細胞中高表達，而在肝細胞癌SMMC7721 細胞和對照L-02 細胞中低表達或不表達；提示FXYD6蛋白在不同的肝細胞癌細胞中存在差異表達，并選擇FXYD6 低表達的SMMC7721 細胞進行后續實驗。本研究結果顯示，隨著藥物濃度增加和作用時間延長，兩組細胞增殖抑制率均呈升高趨勢；5-Fu 濃度為12.5 μg/mL 時，兩組作用24、36、48 h 的細胞增殖抑制率比較均無明顯差異；5-Fu 濃度為 25、50、100 μg/mL 時，過表達組作用 24、36、48 h 的細胞增殖抑制率均明顯低于對照組同時間點。因臨床工作中化療患者5-Fu 基本上是作用48 h，而 12.5 μg/L 5-Fu 作用后兩組細胞增殖抑制率沒有統計學差異，因此選擇25μg/L 5-Fu作用48 h進行細胞凋亡實驗；結果顯示，觀察組細胞凋亡率明顯低于對照組。以上均說明，FXYD6可降低5-Fu對肝細胞癌SMMC7721細胞的化療敏感性。既往研究顯示，5-Fu 的癌細胞耐藥機制包括細胞內藥物富集減少、凋亡相關蛋白異常表達，細胞凋亡減少、DNA損傷修復和細胞周期相關蛋白表達異常等［19］。本研究FXYD6 蛋白表達升高促進了SMMC7721 細胞對5-Fu 的化療耐藥性，其機制可能與通過影響鈉—鉀泵活性而減少細胞凋亡有關，仍需進一步證實。

綜上所述，FXYD6 蛋白過表達可降低肝細胞癌SMMC7721 細胞對5-Fu 的化療敏感性。靶向調控FXYD6 蛋白表達有望成為提高肝細胞癌患者化療敏感性的有效手段，但是其在體內對肝細胞癌細胞化療敏感性的作用機制仍需進一步驗證。