兒童幽門螺桿菌感染后的胃內菌群結構分析*

湯志鴻，蔣豐智，黎小秀，段高羊，廖 瓊

東莞市婦幼保健院兒科,廣東 東莞 523000

目前國內外關于兒童胃微生態研究甚少，幽門螺桿菌（HP）是胃內第一個被發現的細菌，全球超過一半的人口感染幽門螺桿菌［1］，中國兒童幽門螺桿菌感染率為12.8%［2］，幽門螺桿菌感染后兒童會出現非特異性癥狀，如嘔吐，惡心，體重減輕，嘔血和食欲下降。慢性幽門螺桿菌感染可引起生長發育遲緩、缺鐵性貧血、免疫性血小板減少癥［3］。幽門螺桿菌菌株、宿主、內環境等多方面因素決定了疾病的發生發展。目前兒童人群中缺乏關于胃細菌群落的存在和組成的研究，本研究對東莞市婦幼保健院門診及住院部有消化道臨床癥狀而接受胃鏡檢查的患兒，鉗取胃黏膜標本用于快速尿素酶試驗、組織病理學檢查、DNA提取，分析HP陽性組和HP陰性組兩組之間的社會人口資料學、體重指數、尿素呼氣試驗、病理組織結果等臨床特征，通過16SrDNA檢測技術分析HP感染后兒童胃黏膜中的微生態菌群的變化，探索幽門螺桿菌感染對胃內菌群結構組成的影響，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集東莞市婦幼保健院兒科門診及住院部有消化道臨床癥狀來就診的患兒，不同程度伴有腹痛、腹脹、惡心、嘔吐、噯氣及食欲不振等不適癥狀；年齡＜14周歲，既往未進行過抗HP治療。完善13 C尿素呼氣試驗、糞便HP抗原檢測，完善胃鏡檢查、鉗取胃黏膜標本用于快速尿素酶試驗、組織病理學檢查、DNA提取。按幽門螺桿菌感染的診斷標準：符合下述四項之一者可判斷為HP現癥感染［4］：（1）組織病理學檢查和快速尿素酶試驗均陽性；（2）尿素呼氣試驗或糞便HP抗原檢測陽性，并且組織病理學檢查或快速尿素酶試驗結果其中一項陽性；（3）有消化性潰瘍出血，病理組織學或尿素呼氣試驗中任一項陽性。將患者分為HP陰性組14例和HP陽性組26例。

1.2 方法

（1）胃黏膜標本采集，胃鏡下分別鉗取受試者胃竇黏膜活檢樣本，大小約1 mm×2 mm。取材后標本置于無菌凍存管中并加入500 uL生理鹽水，立即于-80℃保存。（2）基因組DNA提取和16S rDNA擴增測序：將胃黏膜組織連同生理鹽水轉移至組織研磨器進行組織勻漿，使用試劑盒QIAamp@DNA Mini Kit(QIAGEN，Germany)提取樣本總DNA，具體操作步驟見說明書。設計引物，對16S rDNA V3-V4區進行擴增，引物序列為：341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(GGACTACNNGGG

—TATCTAAT)。PCR純化、純化PCR產物，純化產物進行測序反應，應用Illumina HiSeq 2000測序平臺，分析測序結果，分析在門、屬分類水平統計各樣本的群落組成。

1.3 統計學方法

使用SPSSl3.0軟件進行統計整理分析，χ2檢驗比較HP陽性組和HP陰性組體重指數、病理組織結果的差異。Mann-Whitney U檢驗比較HP陽性組和HP陰性組微生物群落的豐度和多樣性差異。統計各樣本在門、屬分類群的分布情況，并用柱狀圖進行展示。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HP陽性組和HP陰性組臨床特征分析

兩組之間的社會人口資料學、體重指數、尿素呼氣試驗、病理組織結果等臨床特征分析。HP陽性組26人，男性14例，女性12例，平均年齡（7.66±1.69）歲。陰性組14人，男性8例，女性6例，平均年齡（7.45±1.63）歲。對兩組患者的年齡、性別資料進行比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。HP陽性組體重過低（BMI＜18.5 kg/m2）的患兒比例為69.2%，非體重過低（BMI＞18.5 kg/m2）的患兒比例為30.3%（P=0.04），幽門螺桿菌感染組患兒體重過低，差異有統計學意義。病理組織結果顯示，HP陽性組活動性淺表性胃炎、出血性胃炎、胃潰瘍的比例高于HP陰性組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 HP陽性組和HP陰性組臨床特征分析 例(%)

2.2 多樣性分析

通過對測序所得的細菌物種數量的稀釋曲線來表示物種豐度和多樣性，見圖1。HP陰性組的物種豐度和物種多樣性高于HP陽性組，差異有統計學意義（P=0.001），表明幽門螺桿菌感染會顯著降低胃黏膜細菌群落的多樣性。

圖1 HP陽性組和HP陰性組的稀釋性曲線圖

2.3 組間物種差異分析

在門水平，HP陽性組和HP陰性組的優勢物種的種類相同，但所占的比例有所不同，圖2柱狀圖展示兩組的門水平的物種分布。其中HP陽性組為： Proteobacteria變形菌門（64%）、Firmicutes厚壁菌門（13%）、Bacteroidetes擬桿菌門（8%）、Actinobacteria放線菌門（6%）、Fusobacteria梭桿菌門（5%）。而HP陰性組為Proteobacteria變形菌門（46%）、Firmicutes厚壁菌門（23%）、Bacteroidetes擬桿菌門（13%）、Actinobacteria放線菌門（6%）、Fusobacteria梭桿菌門（2%）。

在屬水平上，HP陽性組和HP陰性組兩組在屬水平的物種分布柱狀圖（圖3），HP陽性組Helicobacter螺桿菌屬比例高達62%，螺桿菌屬是變形菌門的一種，這也是引起HP陽性組變形菌門比例明顯升高的因素。除螺桿菌屬外，HP陽性組Prevotella普氏菌屬（7%VS 3%）、Fusobacterium梭桿菌屬(6%VS 3%)比例較HP陰性組高。

圖2 HP陽性組和HP陰性組兩組在門水平的物種分布柱狀圖

圖3 HP陽性組和HP陰性組兩組在屬水平的物種分布柱狀圖

3 討論

傳統上，胃微生物群落特征的方法主要依賴于胃黏膜或胃液的分離培養，但對苛養菌及生長緩慢的細菌分離培養很棘手，80%的細菌是不可培養的［5］。因此傳統的分離培養方法很難全面的認識胃黏膜菌群分布特征。16 SrDNA編碼原核生物16S rRNA的基因，存在于所有細菌、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體和放線菌等原核生物的基因組中［6］，由多個保守區和與之相間的多個可變區組成。保守區為所有細菌共有，細菌之間無顯著差異；可變區在不同細菌之間存在一定程度的差異，具有細菌種屬特異性。PCR擴增16S rDNA V3-V4區，可將標本中的細菌鑒定到門、屬乃至菌株水平。16 SrDNA測序技術因此被視為細菌鑒定與分類的金標準，具有通量高、速度快、準確度高的優勢［7］。Mera等［8］人的研究報道了幽門螺桿菌的感染對身高和體重有重大影響。Goodman等［9］研究了幽門螺桿菌感染的學齡期兒童，結果顯示幽門螺桿菌感染后體重生長速度減慢。在我們的研究中，幽門螺桿菌感染組患兒體重過低（BMI＜18.5 kg/m2），幽門螺桿菌感染后生長受限，可能是幽門螺桿菌感染致慢性胃炎，難治性鐵缺乏性貧血的結果，另一種可能的解釋可能是胃炎影響了控制食欲的激素。成人幽門螺桿菌感染者胃內菌群特征的研究表明，幽門螺桿菌能顯著影響胃內菌群結構［10］，兒童幽門螺桿菌感染也會影響胃內菌群狀態［11］。本研究結果證實，兒童幽門螺桿菌感染后胃黏膜細菌群落數量顯著下降，物種相對豐度下降。幽門螺桿菌感染也影響胃內菌群的結構差異，幽門螺桿菌感染患兒Prevotella普氏菌屬、Fusobacterium梭桿菌屬相對豐度升高，炎癥反應程度會加劇。本研究發現幽門螺桿菌感染后Prevotella普氏菌屬、Fusobacterium梭桿菌屬相對豐度增高，病理組織結果顯示HP陽性組活動性淺表性胃炎、出血性胃炎、胃潰瘍的比例增高，幽門螺桿菌可能與這些細菌相互作用，共同導致胃內一系列疾病的發生發展。

綜上所述，幽門螺桿菌感染影響兒童體重、胃內病理組織、胃內菌群結構，幽門螺桿菌可能與胃內菌群共同促進胃部疾病的發生、發展。從胃微生態的角度，重建胃內微生態環境，對幽門螺桿菌感染相關疾病的治療有良好的臨床意義和應用前景。