類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞lncRNA-miRNA-mRNA 網絡構建及關鍵基因預測

周新朋 金曄華 張潤潤 何東儀

1.上海中醫藥大學，上海 201203；2.上海中醫藥大學附屬光華醫院關節內科，上海 200052

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥性疾病，以關節受累為主，引起關節軟骨和骨的破壞，并最終導致關節的畸形[1]。其發病與遺傳、性別、年齡、吸煙等密切相關[2]。成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）是間充質來源的、具有成纖維細胞特征的滑膜細胞，是RA 發病過程中的主要的效應細胞[3]。

人類基因組絕大部分都可以被轉錄，但只有一小部分（大約2%）轉錄為mRNA，剩余部分則轉錄為不同種類的非編碼RNA[4]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是指長度超過200 nt，但不具有蛋白編碼能力的RNA[5]。lncRNA 可通過競爭內源性RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）機制，通過微小RNA（miRNA）反應元件（microRNA response elements，MREs）競爭性結合miRNA，對基因的表達進行轉錄后調節[6]。

本課題組在美國國立生物技術信息中心的基因表達數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中獲得RA-FLS 細胞的lncRNA 表達芯片數據集，將多個數據集進行合并，構建lncRNA-miRNA-mRNA網絡并預測關鍵的lncRNA。

1 材料與方法

1.1 基因表達芯片數據集的獲取

在GEO 中獲取相關的數據集GSE103578、GSE8 3147、GSE128813，每個數據集中對照組含有3 個健康人滑膜分離的FLS，RA 組含有3 個RA 患者滑膜分離的FLS。使用limma 包[7]進行標準化，通過idmap3 包[8]對探針進行注釋，根據基因名稱將數據集合并，并去除批次效應。

1.2 差異基因的篩查

根據基因類型篩選mRNA 及lncRNA，通過limma包[7]分別進行基因差異表達分析，以logFC >1.0 并且P ＜0.05 的基因為差異表達基因。

1.3 構建lncRNA-miRNA-mRNA 網絡

在lncbase[9]、starBase[10]、miRcode[11]數據庫中，獲得與差異表達的lncRNA 相關miRNA，在miRWalk[12]、TargetScan[13]數據庫中尋找與mRNA 相關的miRNA，二者取交集，通過Cytoscape 軟件[14]，構建lncRNAmiRNA-mRNA 網絡，將網絡中的lncRNA 作為關鍵lncRNA。

2 結果

2.1 芯片數據預處理

對獲得的數據集進行注釋及合并，得到對照組、RA 組各9 個樣本，共有20 050 條基因的數據集，其中mRNA 有14 760 條、lncRNA 有5290 條。去除批次效應后各樣本間數據達到一致性要求（批次效應處理前后數據集均一性變化如圖1 所示），可以進行差異表達分析。

2.2 基因差異表達分析

分別對數據集中的mRNA 和lncRNA 進行差異表達分析。結果顯示，與對照組比較，RA 組mRNA 上調31 條，下調56 條，見圖2A；RA 組lncRNA上調9 條，下調14 條，見圖2B。

圖1 去除批次效應前后基因的表達情況

圖2 基因差異表達分析

2.3 lncRNA-mRNA 共表達分析

對差異表達的mRNA 和lncRNA 進行Pearson 相關性分析顯示，具有明顯相關性的lncRNA 有18 條，mRNA有51 條（R ＞0.85 且P ＜0.05）。構造的lncRNAmRNA共表達網絡見圖3。

2.4 通過數據庫構建lncRNA-miRNA-mRNA 網絡

通過獲取多個數據庫的RNA 信息，得到與共表達的lncRNA、mRNA 有結合位點的miRNA，并取交集，獲得相關miRNA，構建lncRNA-miRNA-mRNA 相關網絡，其中lncRNA 有13 條，包括lncRNA XIST、NR2F2-AS1、LINC01018 等，miRNA 有26 條，mRNA 有46 條。lncRNA-miRNA-mRNA 共表達網絡見圖4。

3 討論

圖3 lncRNA-mRNA 共表達網絡

FLS 是RA 血管翳中最常見的一種細胞類型，通過產生細胞因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶及侵襲關節軟骨導致關節的破壞。RA-FLS 與健康人滑膜FLS 比較，在細胞因子的表達、細胞信號通路的激活、原癌基因的表達方面存在明顯不同[15]，這些不同可能與RA-FLS 的表觀遺傳學改變有關[16-17]。

lncRNA 的作用機制多樣，可在轉錄和轉錄后改變基因的表達，調節各種生物學過程。最近發現可通過與miRNA 相互作用，改變miRNA 的表達水平，在轉錄后調節基因表達。lncRNA 與mRNA 競爭性結合MRE，可先通過計算機預測lncRNA-miRNA-mRNA 之間的相互關系[18]，為進一步實驗驗證提供指導。

有研究顯示XIST 是多種腫瘤的原癌基因[19]，本研究發現XIST 在基因表達芯片中差異表達，并且與多個miRNA、mRNA 相互作用，Wang 等[20]發現XIST 在骨性關節炎（OA）樣本中表達升高，XIST 及MMP-13、ADAMTS5 為miR-1277-5p 的靶基因，通過ceRNA 機制競爭性結合miR-1277-5p，導致MMP-13、ADAMTS5升高，促進細胞外基質的降解，RA 與OA 發病存在共有機制[21]，XIST 的研究對RA 骨破壞機制的研究具有參考意義。NR2F2-AS1 在多種腫瘤中具有重要作用，NR2F2-AS1 在非小細胞肺癌組織及細胞中表達升高，通過與BMI1 競爭性結合miR-320b 而與腫瘤的TNM 分期、患者的淋巴結轉移相關[22]。LINC01018 在肝臟內可以通過RNA 結合蛋白HuR 調節脂肪酸氧化相關基因的表達[23]。肝癌細胞中LINC01018 的DNA甲基化水平改變，導致在肝細胞癌中表達水平下降，抑制肝癌細胞增生減弱[24]。

圖4 lncRNA-miRNA-mRNA 共表達網絡

lncRNA 在RA 中的作用已在多項研究中被證實，但是主要集中在HOTAIR、LincRNA-p21 等被廣泛研究的lncRNA 中，其他lncRNA 在RA 中的作用還需要進一步尋找并驗證[25]。本研究發現關鍵lncRNA 有13 條，可以構建復雜的lncRNA-miRNA-mRNA 網絡，進一步揭示了lncRNA 在RA-FLS 細胞中的功能機制。