基于生物信息學分析的乳腺癌4-miRNAs預(yù)后模型

鄧姍姍，張廷友，李寧

遵義醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院胸部腫瘤科，貴州 遵義563000

根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)的報道，2020年乳腺癌已超過肺癌成為最常見的人類癌癥，全球新發(fā)病例226萬，約占新發(fā)癌癥病例的11.7%，占女性癌癥死亡人數(shù)首位，而中國乳腺癌的發(fā)病率居全球第一。乳腺癌是多學科綜合治療最成功的癌種之一，早期乳腺癌患者的5年生存率可達80%以上[1]。然而，仍然有部分患者在短期內(nèi)出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移，這顯著縮短了患者的生存時間，復發(fā)轉(zhuǎn)移是導致乳腺癌患者癌癥相關(guān)性死亡的主要原因[2]。因此，尋找合適的預(yù)測因子評估患者預(yù)后是臨床腫瘤學專家亟需解決的問題。微小RNA(micro-RNA，miRNAs)系短鏈非編碼RNA，參與乳腺癌發(fā)展演變的多個生物學過程[3-4]。

研 究 報 道，miR-141[5]、miR-31[6]、miR-105[7]等miRNAs的在乳腺癌中上調(diào)，可促進乳腺癌細胞增殖、遷移，是乳腺癌患者預(yù)后不良的分子標志物[8]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs能夠作為評估乳腺癌患者生存的預(yù)測因子，且多個miRNAs組合的預(yù)測因子更具優(yōu)勢[9]。因此，本研究擬對TCGA(the Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進行深入挖掘以建立預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的miRNAs模型，為其個體化治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與整理 本研究于2020年12月18日檢索TCGA數(shù)據(jù)庫，并下載乳腺癌相關(guān)miRNA(腫瘤樣本446個，正常樣本45個)和mRNA(腫瘤樣本1 069個，正常樣本111個)表達數(shù)據(jù)和臨床信息(426例)；從miRBase(http://www.mirbase.org/)下載miRNA成熟序列。

1.2 差異分析 使用R語言(4.0.3版)進行統(tǒng)計分析，采用edgeR包對腫瘤組織和正常組織中差異表達的miRNA和mRNA進行提取，設(shè)置錯誤發(fā)現(xiàn)率的指標(false discovery rate，F(xiàn)DR)＜0.05，|log2FC|＞1(FC為差異倍數(shù)，fold change)。

1.3 預(yù)后模型構(gòu)建及評價 剔除生存時間＜30天及生存狀態(tài)未知的臨床數(shù)據(jù)后，將差異表達的基因與整理后的臨床數(shù)據(jù)合并。采用caret包將本研究隊列隨機分為實驗(Train)組和驗證(Test)組，對Train組進行單因素Cox回歸分析，篩選出P＜0.05的miRNA作為候選預(yù)測因子；采用survival包對候選預(yù)測因子進行多因素Cox回歸分析并構(gòu)建預(yù)后模型。根據(jù)預(yù)后模型計算各組的風險評分，以Train組的風險評分中位數(shù)作為cut-off值，將患者分為高風險及低風險組。采用Kaplan-Meier(K-M)法繪制生存曲線。計算5年生存率受試者工作特征曲線(ROC)及曲線下面積(AUC)，以此評估模型的預(yù)測精度。

1.4 獨立預(yù)后分析 通過單因素及多因素Cox回歸分析，計算臨床變量及風險評分與患者生存率的相關(guān)性，并判斷該模型是否可以作為獨立的預(yù)后因素。

1.5 靶基因預(yù)測和功能富集分析 采用Targetscan、miRDB和miRTarBase三個工具預(yù)測本預(yù)后模型中miRNA的靶基因，將≥2個工具同時預(yù)測到的靶基因與差異表達的mRNA取交集；對上述取交集后得到的目標基因進行基因本體論(Gene Ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析(過濾條件為P＜0.05，q＜1)。

1.6 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)篩選核心基因 利用STRING網(wǎng)站(https://string-db.org/)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(置信參數(shù)為0.7)，通過Cytoscape3.8.2軟件篩選核心基因。

2 結(jié)果

2.1 miRNAs預(yù)后模型構(gòu)建及評價 本研究共篩選出298個差異miRNA(上調(diào)205個，下調(diào)93個)，將395例生存狀態(tài)明確且生存時間≥30 d的患者，隨機分為Train組199例和Test組196例。Train組經(jīng)單因素Cox回歸分析得到11個與預(yù)后相關(guān)的miRNA(P＜0.05)，逐步經(jīng)多因素Cox回歸分析剔除引起多重共線性的miRNA，最后構(gòu)建了由hsa-miR-148b、hsa-miR-148b-5p、hsa-miR-487a-5p和hsa-miR-452-3p四個miRNA組成的4-miRNAs預(yù)后模型。風險評分=(hsa-miR-148b-5p表達量0.285 424 9)(hsa-miR-503-5p表達量0.280 636)(hsa-miR-487a-5p表達量0.311 300)(hsa-miR-452-3p表達量0.150 980)。以Train組風險評分中位數(shù)(0.965)作為cut-off值，將患者分為高風險及低風險組，結(jié)果提示高風險組乳腺癌患者的5年生存率低于低風險組患者(P＜0.05，圖1)，生存狀態(tài)圖提示高風險組死亡率更高(圖2)；三組患者5年生存率ROC曲線下AUC值分別為0.868、0.669、0.802(圖3)。

圖1 生存曲線圖

圖2 高低風險組患者生存狀態(tài)

圖3 ROC曲線

2.2 獨立預(yù)后分析 單因素Cox回歸分析提示4-miRNAs預(yù)后模型與總生存率相關(guān)(HR=1.325，P=0.005，圖4)。多因素Cox回歸分析提示，即使在考慮其他臨床因素時，4-miRNAs預(yù)后模型同樣可作為影響乳腺癌患者生存率的獨立預(yù)后因素(HR=1.325，P=0.006，圖5)。此外，年齡、N分期和轉(zhuǎn)移狀態(tài)也是影響乳腺癌患者生存率的獨立的預(yù)后因素(P＜0.05)。

圖4 單因素獨立預(yù)后分析

圖5 多因素獨立預(yù)后分析

2.3 4-miRNAs模型靶基因預(yù)測和功能富集分析 取≥2個靶基因預(yù)測軟件預(yù)測結(jié)果的交集后，hsa-miR-148b-5p、hsa-miR-503-5p、hsa-miR-487a-5p、hsa-miR-452-3p四個miRNA分別得到491、493、434、638個重疊靶基因。本研究共篩選出7 388個在乳腺癌中差異表達的mRNA(上調(diào)4 946個，下調(diào)2 442個)，與上述重疊靶基因取交集后得到183個目標靶基因。對前20個目標靶基因進行GO富集分析，并繪制CC(cellular component)、BP(biological process)和MF(molecular function)圖。富集結(jié)果顯示BP主要包括：發(fā)育細胞生長、成纖維細胞遷移的正調(diào)控、跨膜轉(zhuǎn)導；CC主要包括離子通道復合體、跨膜轉(zhuǎn)運復合體、電壓門控鉀通道復合體；MF主要包括：肝素結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合、硫化合物結(jié)合、鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運活性、生長因子活性、受體配體活性。KEGG通路主要包括病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用、細胞因子與細胞因子受體的相互作用、軸突導向、TGF-beta信號通路、p53和PI3K-Ak信號通路(P＜0.05)。

2.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)篩選核心基因183個經(jīng)過濾后得到的目標靶基因被用于PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，篩選得到 的 前10個 核 心 基 因 為IL6、IGF1、SEMA6D、MGAM、CXCR4、PPBP、CXCL11、SGK1、KCNJ3、HCN4。

3 討論

乳腺癌是高度異質(zhì)性的腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是多基因共同參與的過程，不同亞型之間的分子生物學特征、臨床表現(xiàn)及治療反應(yīng)均存在很大的差異，在精準醫(yī)療時代，充分考慮患者的分子特征，有利于制定更加精準的個體化治療方案。但目前存在的TNM分期、病理學分型、組織學分型等預(yù)后因素尚不能完全對患者進行精細的個體化區(qū)分。因此，尋找可個體化預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的模型意義重大。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫，對乳腺癌組織中差異表達的miRNA進行篩選和分析，最后構(gòu)建了由hsa-miR-148b-5p、hsa-miR-503-5p、hsa-miR-487a-5p、hsa-miR-452-3p四個miRNA組成的4-miRNAs預(yù)后模型。經(jīng)檢測該預(yù)后模型的預(yù)測效能較高，Train組、Test組和所有樣品5年生存率ROC曲線下AUC值分別為0.868、0.669、0.802。生存曲線提示高風險評分患者預(yù)后較低風險評分患者差，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示該模型可用于乳腺癌患者的預(yù)后預(yù)測。單因素Cox回歸分析提示該預(yù)后模型與乳腺癌患者生存率相關(guān)，多因素Cox回歸分析提示該模型可作為影響乳腺癌患者生存率的獨立預(yù)后因素。

CIMINO等[10]指出miR-148b是ITGA5，ROCK1，PIK3CA/p110α、NRAS、CSF1信號轉(zhuǎn)導通路的重要調(diào)節(jié)因子。ZHANG等[11]發(fā)現(xiàn)miR-148b通過靶向PTEN通路可促進乳腺癌細胞的生長。CHEN等[12]發(fā)現(xiàn)miR-148/152家族通過負調(diào)控SPIN1的表達，增強乳腺癌細胞對阿霉素的耐藥性。ZHAO等[13]發(fā)現(xiàn)miR-503通過靶向SMAD2和E鈣粘蛋白促進乳腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。MA等[14]發(fā)現(xiàn)miR-487a通過調(diào)節(jié)BCRP的表達，可逆轉(zhuǎn)乳腺癌化療耐藥。XIAO等[15]發(fā)現(xiàn)miR-452在乳腺癌細胞中對LINC0092與SFRP1、RGMA有調(diào)節(jié)作用。前期研究提示本模型中的四個miRNA均在乳腺癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

GO富集分析顯示4-miRNAs預(yù)后模型的靶基因主要定位于細胞膜，參與離子、蛋白跨膜轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導，具有跨膜轉(zhuǎn)運活性、生長因子活性、受體配體活性等功能。KEGG主要富集在TGF-beta、p53和PI3K-Ak等信號通路上。前期文獻指出p53[16]、PI3K[17]和TGF-beta[18]等信號通路均與乳腺癌預(yù)后相關(guān)。這些富集結(jié)果在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著不同的作用，提示本研究所構(gòu)建的4-miRNAs模型對乳腺癌信號通路的調(diào)節(jié)有重要意義。本研究所篩選出來的前十位核心基因IL6、IGF1、SEMA6D、MGAM、CXCR4、PPBP、CXCL11、SGK1、KCNJ3、HCN4均與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19-22]。

本研究的不足之處在于本研究的數(shù)據(jù)僅來源于TCGA數(shù)據(jù)庫，未對其他數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進行分析。此外，該模型尚未得到實驗驗證，后續(xù)將進行實驗驗證。

綜上所述，本研究構(gòu)建了一種基于miRNA的可靠獨立預(yù)后模型，為乳腺癌患者臨床治療策略的制定提供了理論依據(jù)，有助于乳腺癌患者的個體化管理，對于本模型評分為高風險患者可能需要采取更積極的治療方式。